Estructura, catálisis, transporte de quitina e inhibición selectiva de la quitina sintasa.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4776 (2023) Citar este artículo

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La quitina es uno de los biopolímeros naturales más abundantes y sirve como componente estructural crítico de las matrices extracelulares, incluidas las paredes celulares de hongos y los exoesqueletos de insectos. Como polímero lineal de N-acetilglucosamina unida a β-(1,4), la quitina se sintetiza mediante quitina sintasas, que se reconocen como objetivos para fármacos antifúngicos y antiinsectos. En este estudio, determinamos siete estructuras diferentes de microscopía crioelectrónica de una quitina sintasa de Saccharomyces cerevisiae en ausencia y presencia de inhibidores de nucleósidos peptidil o donadores, aceptores, productos de glicosilo. Combinadas con análisis funcionales, estas estructuras muestran cómo los sustratos donante y aceptor se unen en el sitio activo, cómo la hidrólisis del sustrato impulsa el autocebado, cómo se abre un canal transmembrana conductor de quitina y cómo los inhibidores de peptidil nucleósidos inhiben la quitina sintasa. Nuestro trabajo proporciona una base estructural para comprender la función y la inhibición de la quitina sintasa.

La quitina es el segundo polisacárido natural más abundante en la Tierra después de la celulosa, y los organismos vivos producen aproximadamente 100 mil millones de toneladas de quitina cada año1. La quitina es un componente primario de las paredes celulares de los hongos, los exoesqueletos de crustáceos e insectos, y juega un papel esencial en la reproducción, crecimiento o desarrollo de estos organismos2. La quitina es un polímero de cadena larga de N-acetilglucosamina (GlcNAc) unida a β-(1,4) y se sintetiza mediante la quitina sintasa en la membrana plasmática3,4. La quitina sintasa cataliza la formación de enlaces glicosídicos β (1 → 4) en la quitina mediante el uso de GlcNAc activada por UDP (UDP-GlcNAc) como donante de azúcar y, mientras tanto, transporta el producto polisacárido a través de la membrana (Fig. 1a).

a Esquema de síntesis y transporte de quitina por Chs1. b Ensayo in vitro de UDP-Glo ​​glicosiltransferasa con Chs1 purificado en tampón con (WT) o sin (noGlcNAc) GlcNAc. El ensayo en condiciones WT también se realizó con EDTA, tripsina, NikkoZ o PolyB. La reacción sin Chs1 se utilizó como control. Los puntos de datos representan la media ± DE por triplicado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c Ensayo de síntesis de quitina in vitro con Chs1 purificado en tampón con (WT) o sin (noGlcNAc) GlcNAc. El ensayo en condiciones WT también se realizó con EDTA y tripsina. La reacción sin Chs1 se utilizó como control. Los puntos de datos representan la media ± DE por triplicado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d Mapa Cryo-EM y modelo atómico del dímero apo Chs1. e Representación en dibujos animados del monómero Chs1. El polipéptido se muestra en un arco iris desde el extremo N al C. El supuesto sitio activo está resaltado por un círculo naranja. El supuesto canal de transporte de quitina está delimitado por una flecha violeta. f Topología de dibujos animados del monómero Chs1. g El mapa del dominio Chs1. Los principales dominios y motivos están etiquetados. La región N-terminal invisible está en blanco.

En Saccharomyces cerevisiae, la quitina sintasa está codificada principalmente por CHS1, CHS2 o CHS3. La eliminación simultánea de los tres genes es letal en la levadura5. ScChs1 y ScChs2 pertenecen a la misma familia de quitina sintasa, que contiene diferentes números de hélices transmembrana de ScChs36. ScChs1 y ScChs2 son responsables de sintetizar el tabique primario y están relacionados con la separación celular en la citocinesis, mientras que ScChs3 es responsable de la formación de quitina en el anillo de la yema y quitina dispersa en la pared celular5,7,8,9,10,11. Estudios anteriores indicaron que Chs1 se encuentra principalmente en forma de zimógeno y puede activarse mediante proteólisis3,12,13.

La quitina sintasa pertenece a la familia de glicosiltransferasas 2 inversoras que contienen pliegues GT-A, que también incluye hialuronano y celulosa sintasas14,15. En los últimos años, se han informado estructuras de hialuronano y celulosa sintasas, lo que proporciona información estructural sobre sus mecanismos de funcionamiento16,17,18,19,20,21. Sin embargo, no se ha determinado la estructura de la quitina sintasa, lo que dificulta una comprensión mecanicista de los mecanismos catalíticos y de transporte de quitina sintasa.

Como la quitina no está disponible en plantas y vertebrados, la biosíntesis de quitina se considera un objetivo atractivo para fungicidas, insecticidas, acaricidas y fármacos antifúngicos4,22. Por ejemplo, con similitud estructural con UDP-GlcNAc, la polioxina B (PolyB) es un inhibidor competitivo de peptidil nucleósido de la quitina sintasa y se ha utilizado ampliamente como agente antifúngico contra hongos fitopatógenos y plagas de artrópodos en agricultura y silvicultura durante décadas23,24. Nikkomycin Z (NikkoZ), otro peptidil nucleósido inhibidor de la quitina sintasa, ha demostrado importantes beneficios clínicos en mamíferos contra hongos patógenos25,26. La determinación de las estructuras de la quitina sintasa en complejo con estos inhibidores proporcionará información sobre el mecanismo inhibidor a nivel atómico de la quitina sintasa por los inhibidores de peptidil nucleósidos y también es muy útil para el desarrollo de nuevos fármacos antimicóticos.

En este informe, determinamos siete estructuras de microscopía crioelectrónica (crio-EM) de S. cerevisiae Chs1 en estado apo y en complejo con UDP-GlcNAc, UDP-GlcNAc+GlcNAc, UDP, UDP+GlcNAc, PolyB y NikkoZ. . Nuestros estudios proporcionan información molecular sobre cómo se unen los sustratos donantes y aceptores en el sitio activo, cómo se inicia la síntesis de quitina, cómo funciona el canal transmembrana conductor de quitina y el mecanismo molecular de cómo los inhibidores de peptidil nucleósidos inhiben la quitina sintasa.

Chs1 se sobreexpresó en S. cerevisiae con una etiqueta FLAG triple C-terminal y se purificó con resinas anti-FLAG seguidas de cromatografía de exclusión por tamaño (Figuras complementarias 1a, b). Se utilizaron el detergente lauril maltosa neopentilglicol (LMNG) y succinato de hidrógeno y colesterol (CHS) para estabilizar la proteína de la membrana. Estudios anteriores que utilizaron lisados ​​​​celulares directamente o muestras crudas purificadas sugirieron que Chs1 está inactivo in vitro y podría activarse mediante proteólisis3,12,13. Para verificar esta proposición, realizamos un ensayo de UDP-Glo ​​glicosiltransferasa y un ensayo de síntesis de quitina in vitro utilizando Chs1 purificado (Fig. 1b, c). Después de incubar Chs1 purificado o Chs1 digerido con tripsina con UDP-GlcNAc durante 60 minutos, medimos el UDP libre en la solución de reacción con un kit UDP-Glo ​​o detectamos el producto de quitina mediante el método inmuno-HRP acoplado a WGA (aglutinina de germen de trigo)27. WGA es una lectina dimérica que exhibe una alta afinidad de unión por residuos u oligómeros de GlcNAc. De acuerdo con estudios previos, los resultados de ambos ensayos revelaron que la actividad de Chs1 mejoró con la proteólisis de tripsina entre aproximadamente 1,5 y 3 veces. Para nuestra sorpresa, también detectamos cierta baja actividad para Chs1 purificado solo (Fig. 1b, c), lo que se confirmó además mediante un ensayo adicional de síntesis de quitina in vitro mediante la tinción de quitina sintetizada con blanco de calcoflúor (CFW) (Figura complementaria 2a). , b). CFW es una tinción de fluorocromo no específica para polisacáridos con enlaces 1,3-β y 1,4-β y muestra fluorescencia cuando se expone a luz ultravioleta de longitud de onda larga28,29,30. Además, la actividad de hidrólisis UDP-GlcNAc de Chs1 en un tampón con o sin EDTA reveló que la actividad de Chs1 depende de Mg2+ (Fig. 1b, c).

Aparentemente, la actividad de detección de nuestro Chs1 purificado va en contra de estudios previos que afirmaban que el Chs1 de tipo salvaje está inactivo. Una explicación plausible es que la muestra purificada había sido digerida por una proteasa endógena durante la purificación y, por tanto, activada. Para confirmar esta hipótesis, realizamos una nueva purificación de Chs1 con exceso de inhibidores de proteasa durante toda la purificación (Figuras complementarias 1a, c). Sorprendentemente, el nuevo Chs1 purificado es una mezcla de dos proteínas como se muestra en SDS-PAGE. El análisis de transferencia Western anti-bandera mostró que ambas proteínas pertenecen a Chs1, mientras que la más grande tiene el mismo tamaño que Chs1 de tipo salvaje en la membrana (Figura complementaria 1d). Una espectrometría de masas de digestión tríptica adicional para las dos proteínas indicó que la proteína más grande es de hecho Chs1 de tipo salvaje, mientras que la proteína más pequeña carece de aproximadamente 150 residuos N-terminales de Chs1 (Figura complementaria 1e, f). En conjunto, estos resultados indicaron que Chs1 purificado fue parcialmente digerido en la región N-terminal por la proteasa endógena y, por lo tanto, fue parcialmente activado.

Para comprender cómo la proteólisis de tripsina activa Chs1, incubamos Chs1 purificado con tripsina en diferentes proporciones de masa y tiempos, y analizamos el producto mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas de digestión tríptica (Figuras complementarias 3a-c). Mostramos que la proteólisis de Chs1 purificada mediante tripsina generó un producto con un peso molecular de ~ 35–40 kDa menor que el Chs1 de tipo salvaje (Figuras complementarias 3a, b), y es probable que la tripsina elimine los primeros ~ 340 residuos en el extremo N-terminal de Chs1. tratamiento (Figura complementaria 3c). Para confirmar aún más este hallazgo, expresamos y purificamos un Chs1 truncado eliminando 340 residuos N-terminales (Chs1-ΔN). Descubrimos que Chs1-ΔN tiene aproximadamente el mismo tamaño que el producto digerido de Chs1 purificado por tripsina (Figura complementaria 3a), y no era sensible a la proteólisis de tripsina como la muestra purificada anteriormente. La actividad de Chs1-ΔN también es similar a la del Chs1 de tipo salvaje tratado con tripsina (Figura complementaria 3d). El hallazgo es consistente con nuestra estructura crio-EM de Chs1, en la que los primeros ~380 residuos de Chs1 están en gran medida desordenados y, por lo tanto, son más sensibles a la proteólisis de tripsina (Fig. 1d-g). Este hallazgo también es consistente con un estudio previo de que la eliminación de la región N-terminal no homóloga de Chs1 y Chs2 tuvo poco efecto sobre la actividad enzimática activada por tripsina de la sintasa correspondiente31. En conjunto, nuestros resultados revelaron que la activación por proteólisis del zimógeno Chs1 es para eliminar la región N-terminal (NTR), y la región N-terminal del zimógeno Chs1 probablemente desempeña una función inhibidora.

Realizamos un análisis crio-EM de una sola partícula en Chs1 purificado directamente y las muestras se incubaron con UDP-GlcNAc, UDP-GlcNAc + GlcNAc, UDP, PolyB y NikkoZ. Los promedios de Cryo-EM 2D mostraron que Chs1 presentaba una arquitectura dimérica, de acuerdo con el volumen de elución en la filtración en gel (Figuras complementarias 1a, c, d). Finalmente, obtuvimos ocho mapas 3D crio-EM de Chs1 en siete estados diferentes en un rango de resolución de 2,4 Å a 3,6 Å (Figuras complementarias 4 a 10, Tabla complementaria 1).

Utilizando la estructura predicha de AlphaFold2 como modelo inicial, construimos el modelo atómico de Chs1 en estado apo en el mapa crio-EM con una resolución de 2,6 Å (Fig. 1d – f, Fig. complementaria 5). A excepción de la región N-terminal y algunos bucles cortos, Chs1 está en su mayor parte ordenado y bien resuelto (Fig. 1d-f, Fig. Suplementaria 11). También construimos modelos atómicos para los seis mapas 3D restantes de Chs1, que tienen resoluciones ligeramente más bajas. Todos estos modelos se refinaron para obtener buenas estadísticas (Tabla complementaria 1) y se ajustan bien a los mapas 3D (Figura complementaria 12). Al comparar los mapas 3D de Chs1 en los estados apo, unido a UDP-GlcNAc, unido a UDP-GlcNAc+GlcNAc, unido a UDP, unido a UDP+GlcNAc, unido a PolyB y unido a NikkoZ, pudimos modelar los sustratos e inhibidores correspondientes, que todos tenía densidades claras en el sitio activo (Figura complementaria 13).

La levadura Chs1 tiene 1131 residuos (Fig. 1g). La estructura general de Chs1 revela una arquitectura de dímero con una doble simetría y mide ~ 100 Å de alto y 110 Å de ancho (Fig. 1d). Cada monómero Chs1 está compuesto por una gran región citosólica soluble y un dominio transmembrana (TMD), con el extremo N y el extremo C en el citosol. Excepto un bucle corto que va de 245 a 271 residuos, los primeros 374 residuos de Chs1 están en gran medida desordenados e invisibles en nuestros mapas crio-EM. Después del extremo N flexible se encuentra el dominio glicosiltransferasa (GTD), que se encuentra en un pliegue GT-A conservado con una lámina β de 10 hebras intercalada por varias hélices α y algunas láminas β. En el dímero Chs1, los dos GTD no interactúan directamente y probablemente funcionan de forma independiente. El dominio transmembrana de Chs1 contiene 6 hélices transmembrana (TMH) y se caracteriza por un TMH1 retorcido (Fig. 1e, f). Los TMH están conectados en su mayoría mediante bucles cortos, excepto por un bucle de intercambio de dominio citosólico (T969 a T1024) entre TMH4 y TMH5 y un bucle extracelular (EL3) que conecta TMH5 y TMH6. En particular, tanto el bucle de intercambio como EL3 participan en la formación de la interfaz del dímero Chs1 (descrita a continuación). GTD interactúa con el TMD principalmente a través de tres hélices de interfaz anfipática (IF1–3). Entre ellos, IF1 (P645 a F668) e IF2 (V750 a S780) están próximos a TMH1, mientras que IF3 (Q934 a N963) se inserta entre TMH4 y TMH5. Entre GTD y TMD se presenta una gran bolsa correspondiente al supuesto sitio catalítico. Debajo hay un gran bolsillo interior en la región transmembrana, que corresponde al supuesto canal de transporte de quitina (Fig. 1e).

Hay principalmente tres interfaces proteína-proteína en el dímero Chs1: empaquetamiento apretado por TMH2 y TMH5 de ambos protómeros, la interacción entre EL3 en el lado exoplásmico y TMH2' del protómero vecino, y la interacción del bucle de intercambio con GTD' de el otro protómero (Fig. 2a – c). Específicamente, TMH2 y TMH5 interactúan con TMH2 ', principalmente mediante interacciones hidrofóbicas, y forman una forma de "V" invertida, que genera una cavidad considerable en el lado exoplásmico de la membrana (Fig. 2b). Curiosamente, encontramos que dos moléculas de fosfolípidos llenaron completamente esta cavidad y fueron selladas en su interior por EL3. Todas las cadenas de acilo de los dos lípidos están dobladas, formando extensas interacciones hidrofóbicas con TMH2 y TMH5. Los grupos cabeza y fosfato de los lípidos forman enlaces de hidrógeno directamente con las cadenas laterales de R871 en TMH5 y T1061 y D1066 en EL3. Claramente, los lípidos desempeñan un papel estructural en la estabilización de la estructura del dímero Chs1. El bucle de intercambio de 56 residuos de Chs1 contribuye a la interfaz del dímero a través de contactos extensos con GTD 'del otro protómero de Chs1 (Fig. 2c). Esta interfaz se caracteriza por muchas interacciones hidrofóbicas a través de L979, I982, V994, I1001, L1009, V1011, L1012 y dos tirosinas (Y1005 e Y1008) en el bucle de intercambio. En la interfaz también participan dos residuos de polor (Q1002 y N1004) y el segmento 989-992 del bucle de intercambio. En particular, este segmento forma una hoja beta con un segmento N-terminal 376–379 de GTD'. La mayoría de estos residuos se conservan (Figura 14 complementaria).

una representación de dibujos animados del dímero Chs1. Las interfaces diméricas están resaltadas por rectángulos negros y naranjas. b Una vista ampliada de la región de la interfaz en el cuadro naranja en (a). La estructura de Chs1 se muestra en una caricatura. Los residuos clave y dos moléculas de fosfolípidos selladas se muestran en presentación en barra. c Una vista ampliada de la región de la interfaz en el cuadro negro en (a). El bucle de intercambio de dominio (SL) de un protómero se muestra en una representación de dibujos animados y el otro protómero se muestra en electrostática de superficie. Los residuos destacados de SL en la interfaz se muestran en forma de barra. d Perfil de filtración en gel del circuito de intercambio Chs1 truncado (ΔSL) y Chs1 de tipo salvaje (WT). e Ensayo in vitro de UDP-Glo ​​glicosiltransferasa de Chs1-ΔSL. Los puntos de datos representan la media ± DE por triplicado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. f Ensayo de síntesis de quitina in vitro de Chs1-ΔSL. Los puntos de datos representan la media ± DE por triplicado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. g Complementación del crecimiento de células w303 de tipo salvaje (w303) y células chs1Δ con plásmido vacío (chs1Δ) o plásmido que porta Chs1 de tipo salvaje (chs1Δ+Chs1) o Chs1-ΔSL (chs1Δ+Chs1-ΔSL). Se capturaron imágenes de células cuando las células crecieron hasta una DO = 1. El fenotipo de la cadena de células es un indicador de hasta qué punto se altera la función de Chs1 in vivo. Se realizaron tres experimentos independientes con resultados similares.

Las densidades del bucle de intercambio en nuestras estructuras determinadas son relativamente más débiles que las de otras partes de Chs1 o incluso invisibles, lo que indica que solo está parcialmente estabilizado (Fig. 1d, Figs. complementarias 4-10, 15a, b). Se construye utilizando la estructura predicha de Alphafold2 como modelo inicial. Tal dinamismo del bucle de intercambio puede ser relevante para la función de Chs1. Para examinar el papel exacto del bucle de intercambio, expresamos y purificamos un Chs1 truncado del bucle de intercambio (Chs1-ΔSL) en una cepa knockout de Chs1, que evitó la formación de un heterodímero de Chs1 y Chs1-ΔSL endógenos de tipo salvaje. El volumen de elución del pico de filtración en gel y el gel nativo demostraron que Chs1-ΔSL purificado es mucho más pequeño que el Chs1 de tipo salvaje (Fig. 2d, Fig. Suplementaria 15c). El gel SDS-PAGE de Chs1-ΔSL purificado mostró que la región N-terminal se ha degradado en gran medida durante la purificación procesada por tripsina (Fig. 15d complementaria), lo que indica que la región inhibidora N-terminal de Chs1-ΔSL es más sensible a la proteólisis. Este hallazgo es consistente con nuestro mapa crio-EM de Chs1 en estado apo, que mostró el segmento 989-992 de paquetes de bucles de intercambio en los segmentos 245-271 y 376-379 de NTR (Fig. 2c, Fig. Suplementaria 15b). Es posible que la eliminación del bucle de intercambio interrumpa por completo la interacción y haga que la NTR sea más flexible para la proteólisis.

Además, realizamos ensayos de actividad para Chs1-ΔSL y encontramos un aumento espectacular de la actividad de Chs1-ΔSL, que era más de ~10 veces mayor que la de nuestro Chs1 purificado (Fig. 2e, f, Fig. complementaria 2a, b). Una actividad tan alta es inesperada porque la proteólisis de tripsina solo mejora la actividad de Chs1 entre 1,5 y 3 veces, como se mencionó anteriormente. Significa que el aumento de la actividad mediante la eliminación del bucle de intercambio no solo es causado por la proteólisis de NTR. Además, es probable que el bucle de intercambio esté directamente involucrado en la restricción de la actividad de Chs1 y desempeñe el principal efecto inhibidor sobre la actividad de Chs1. Si es así, la activación por proteólisis de Chs1 se puede lograr mejorando la flexibilidad del bucle de intercambio.

Como Chs1-ΔSL fue muy activo in vitro, nos preguntamos si Chs1-ΔSL puede reemplazar la función de Chs1 dimérico in vivo o no. Realizamos un ensayo de complementación del crecimiento in vivo de Chs1-ΔSL utilizando la cepa de levadura Chs1Δ (Fig. 2g, Figs. complementarias 15e, 15). Estudios anteriores indicaron que la cepa Chs1Δ forma una cadena de células debido a la alteración de la construcción del tabique primario que separa las células madre e hijas. Descubrimos que esta deficiencia puede complementarse con un plásmido que porta el gen Chs1 de tipo salvaje. Por el contrario, Chs1-ΔSL no pudo rescatar completamente el fenotipo de levadura chs1Δ como el Chs1 de tipo salvaje, lo que indica que el bucle de intercambio es esencial para la función celular regular de Chs1. El estado dimérico alterado o la actividad excesiva de Chs1-ΔSL son posibles razones para esto. También es posible que la eliminación de SL dañe la localización de Chs1 en la membrana plasmática.

Además, notamos que el bucle de intercambio comienza con un motivo WGTKG conservado (Figura complementaria 15a), y se ha demostrado que la mutación de los residuos correspondientes en la levadura Chs2 es esencial para la actividad de síntesis de quitina32. También encontramos que tanto W969A como G970A no pudieron rescatar el fenotipo de levadura chs1Δ (Figuras complementarias 15e, 15), lo que indica el importante papel del motivo WGTKG.

El dominio GT citosólico de Chs1 adopta un pliegue GT-A conservado, con el sitio catalítico putativo en el bolsillo entre GTD y TMD. Para comprender el mecanismo de unión del donante y del aceptor de azúcar, determinamos la estructura de Chs1 en complejo con el donante de UDP-GlcNAc y el aceptor de GlcNAc (estado unido de UDP-GlcNAc + GlcNAc) con una resolución de 2,9 Å (Fig. 3a, Fig. complementaria 6). ). La comparación de este mapa con el mapa en el estado apo reveló densidades adicionales claras en el supuesto bolsillo activo que corresponden al donante de azúcar (UDP-GlcNAc), al aceptor (GlcNAc) y al Mg2+ (Figura complementaria 13). Aunque utilizamos Chs1 de tipo salvaje, UDP-GlcNAc no se hidrolizó en nuestra estructura, probablemente debido a la baja temperatura de incubación y la baja actividad de Chs1.

una vista de primer plano del sitio activo de Chs1 (verde) en complejo con el donante UDP-GlcNAc, el aceptor de GlcNAc (púrpura) y Mg2+ (lima). Los residuos clave se muestran en representación de barras. b Alineación estructural de Chs1 en estados apo, unido a UDP-GlcNAc, unido a UDP-GlcNAc + GlcNAc y unido a UDP. La flecha roja marca el bucle de cambio de Chs1 que se mueve desde la posición apo a la posición invertida. c Complementación del crecimiento de células w303 de tipo salvaje (w303) y células chs1Δ con plásmido vacío (chs1Δ) o plásmido que porta Chs1 de tipo salvaje (WT) o mutantes. En la figura complementaria 13 se muestran imágenes de células representativas. La cadena de células se refiere a una cadena de células no separadas con un número ≥3. Para cada una de estas cepas, se contaron y calcularon> 2000 células utilizando w303 y chs1Δ como controles negativos y positivos. El fenotipo de la cadena celular es un indicador de hasta qué punto se altera la función de Chs1 in vivo. d Comparación estructural entre Chs1 unido a donante UDP-GlcNAc (púrpura) y Chs1 unido a UDP + GlcNAc preparado (cian) mediante la alineación de sus TM. La flecha naranja marca el cambio del dominio GT y el nucleótido hacia la membrana desde el estado unido al donante al estado preparado. El sitio activo está resaltado por un rectángulo azul. El donante de azúcar está resaltado por un rectángulo amarillo. e Vista de primer plano del sitio activo de Chs1 preparado (cian) en complejo con UDP, GlcNAc y dos iones Mg2+ (cal). Esta es una ampliación del rectángulo azul en (d) visto desde la izquierda. Los sustratos y los residuos clave se muestran en representación de barras. f Ampliación del rectángulo amarillo en (d) visto desde atrás. Se muestran el UDP (cian) y Mg2+ (lima) de Chs1 preparado, y UDP-GlcNAc (púrpura) y Mg2+ (púrpura) de Chs1 unido al donante. Los α-, β-fosfatos están etiquetados, destacando una rotación de 180° del β-fosfato de UDP-GlcNAc a UDP.

En la estructura, el grupo de bases de nucleótidos de UDP-GlcNAc está estabilizado por T453, M454, Y455, E457 y K578 en la parte superior del sitio activo mediante la formación de una interacción π-π con Y455 y un contacto hidrofóbico con otros residuos; el fosfato de UDP-GlcNAc interactúa con Q756 y R759 en el motivo QXXRW conservado y un Mg2+; el resto GlcNAc de UDP-GlcNAc está ubicado justo encima de IF2 en una configuración doblada que se extiende hacia afuera desde el sitio activo. En la parte inferior del sitio activo, Y654 en IF1, W760 en IF2, R718 y un motivo VLPGA conservado (residuos 673–677) forman el sitio de unión del aceptor de GlcNAc (Fig. 3a, b). El anillo de GlcNAc se inserta verticalmente en una hendidura entre el anillo de indol de W760 y el anillo de pirrolidina de P675, formando tres anillos paralelos que están separados por aproximadamente 4 Å entre sí. Debajo de la molécula de GlcNAc hay un grupo de residuos cargados que mantienen a GlcNAc en el sitio de unión, como E653, S657 y K662 de IF1. Cabe señalar que el sitio de unión del aceptor es la puerta que conecta el sitio activo con el canal de transporte transmembrana de quitina.

Sorprendentemente, notamos que la distancia entre el grupo hidroxi en C4 del aceptor de GlcNAc y el C1 del resto GlcNAc de UDP-GlcNAc es de hasta ~ 7 Å. Como supuesto residuo de base catalítica, D717 tampoco interactúa con UDP-GlcNAc en la estructura. Estos hallazgos sugieren que es posible que sea necesario girar horizontalmente el resto GlcNAc de UDP-GlcNAc e insertarlo en el sitio activo para la formación de un enlace glicosídico β (1-4) en la siguiente reacción (Fig. 3a). Es probable que la UDP-GlcNAc en nuestra estructura esté en una posición de carga y se convierta a una posición insertada para la hidrólisis del sustrato después de la rotación. En consecuencia, encontramos que el resto GlcNAc de UDP-GlcNAc no interactúa específicamente con ningún residuo y su densidad es ligeramente más débil que la del resto UDP, lo que indica que el grupo GlcNAc conserva cierta flexibilidad (Fig. 3a, Fig. 13 complementaria). ). Además, encontramos que el Mg2+, que estabiliza el β-fosfato, solo está rodeado por E457, D602, T605 y D745, pero no se coordina estrechamente con ningún residuo en la estructura, ya que sus distancias son todas >4 Å. Esto probablemente se deba en parte a que el motivo DxD de coordenadas metálicas conservado en otras glicosiltransferasas plegables GT-A dependientes de metales se reemplaza por un motivo DAG (residuos 602–604) en Chs1 (Fig. 3a, Fig. 14 complementaria). Esta arquitectura del Mg2+ permite el movimiento del β-fosfato.

Mutamos residuos clave en el sitio activo identificado anteriormente y realizamos un ensayo de complementación del crecimiento in vivo (Fig. 3c, Fig. 16 complementaria). Descubrimos que los mutantes N456A/E457A, D602A y E752R del sitio de unión del donante y los mutantes S657F/N658F, K662M, V673S, L674Q, P675L, P675T, G676L, R718L, W760A del sitio de unión del aceptor alteraron significativamente la función de Chs1. ya que no pudieron rescatar el fenotipo de levadura Chs1Δ. Además, K578A, D745R, Q756L y R759A afectaron moderadamente la función Chs1, lo que sugiere que son menos importantes.

La alineación estructural entre Chs1 en los estados unidos apo y UDP-GlcNAc + GlcNAc reveló que la mayoría de los residuos en el sitio activo son casi idénticos, excepto por el bucle VLPGA conservado (Figura complementaria 17a). En el estado apo, el camino desde el sitio activo hasta el canal transmembrana de quitina está bloqueado por el bucle VLPGA, en el que el anillo de prolina de P675 se estabiliza empacándolo con el anillo de indol de W760 (Figs. 1e, 3b). Por el contrario, este bucle se alejó entre 3 y 5 Å en el estado unido UDP-GlcNAc + GlcNAc, lo que resultó en una ruta continua de elongación de quitina desde el sitio activo hasta el bolsillo interior de Chs1 (Figs. 3b, 4a-d). El movimiento del bucle desde el estado unido apo al estado unido UDP-GlcNAc+GlcNAc se parece más a un volteo, ya que las cadenas laterales de V673, L674 y P675 están volteadas casi 180° (Figura complementaria 17b). Como se mencionó anteriormente, el ensayo de complementación del crecimiento de los mutantes P675L, P675T y G676L reveló sus funciones esenciales en la función de Chs1 (Fig. 3c). Posiblemente, invertir el bucle sea uno de los pasos principales en el inicio de la síntesis de quitina por parte de Chs1. Curiosamente, la hialuronano sintasa (HAS) tiene un bucle de conmutación (CVGGP) en una posición similar, pero solo se desplaza ligeramente hacia arriba y hacia abajo durante la catálisis y no funciona como una puerta como el bucle en Chs1 (Figuras complementarias 18c, d) 16. Por lo tanto, también denominamos al bucle de Chs1 "bucle de conmutación", que cierra la ruta de transporte de quitina en el estado de apo y la abre durante la síntesis de quitina (Fig. 4b-d).

una vista en corte de Chs1 (verde) en complejo con UDP-GlcNAc (naranja), GlcNAc (púrpura) y Mg2+ (lima). Chs1 se muestran en dibujos animados y en superficie electrostática. Dos flechas rojas delinean el camino del canal de transporte de quitina. Canal transportador de quitina de Chs1 en estado unido a UDP-GlcNAc + GlcNAc (b) y estado apo (c). El canal fue calculado por el programa HOLE y está ilustrado con puntos azules. La puerta citosólica y la puerta hidrofóbica exoplásmica están resaltadas con flechas rojas. d Se ilustran los tamaños de poro de la vía de transporte de quitina en (b) y (c). e Supuesto canal transportador de quitina transmembrana de Chs1 con residuos que recubren el canal mostrados como barras. Las etiquetas de residuos polares están resaltadas en azul. Las etiquetas de los residuos que forman la puerta hidrofóbica exoplásmica están resaltadas con un fondo amarillo. f, g Dos extremos del análisis 3DVA de la estructura Chs1 unida al donante. El bucle de intercambio de dominio, TMH4 y la salida exoplásmica están etiquetados en dos mapas.

El inicio de la síntesis de quitina requiere la unión del aceptor de GlcNAc en el sitio activo de Chs1. Revelar cómo generar la primera GlcNAc es importante para comprender el mecanismo de la quitina sintasa. Debido a la falta de una fuente de GlcNAc libre in vivo, estudios previos sugieren que las quitina sintasas pueden "autocebarse" generando GlcNAc a partir de UDP-GlcNAc con una actividad hidrolizante de UDP-GlcNAc intrínseca34,35. Consistentemente, encontramos que Chs1 estaba activo en el tampón sin GlcNAc (Fig. 1b, c). Para revelar el mecanismo de autocebado de Chs1, realizamos un análisis crio-EM dependiente del tiempo de Chs1 incubado con un donante UDP-GlcNAc durante 5 min y 40 min y determinamos dos mapas crio-EM de Chs1 con una resolución de 3,1 Å (UDP- GlcNAc-10min y UDP-GlcNAc-40min) (Figuras complementarias 5, 6). De acuerdo con las densidades de los sustratos, encontramos que la estructura UDP-GlcNAc-5 min se encuentra en un estado con UDP-GlcNAc en posición de carga (UDP-GlcNAc-estado de carga), mientras que la estructura UDP-GlcNAc-40 min se encuentra en el estado unido a UDP + GlcNAc (estado preparado) (Figura complementaria 13). Esto indica que Chs1 en la última estructura tiene un donante de UDP-GlcNAc completamente hidrolizado y se autocebó.

En la estructura de carga de UDP-GlcNAc, el bucle de conmutación está en la posición apo, lo que indica que la unión de UDP-GlcNAc no activa el bucle de conmutación (Fig. 3b, d). En la estructura Chs1 preparada, el bucle del interruptor está en la posición invertida y GlcNAc está intercalado por P675 y W760 (Fig. 3d, e). El hidroxilo C3 de GlcNAc forma un enlace de hidrógeno con R718, que posiciona el hidroxilo C4 de GlcNAc hacia el sitio de unión del donante (Fig. 3e). Además, notamos que la hidrólisis de UDP-GlcNAc induce un movimiento de cuerpo rígido del dominio GT hacia la membrana entre ~1,5–2,5 Å, lo que puede ayudar a empujar el producto hacia el canal (Fig. 3d). Al igual que con el dominio GT, el UDP unido también se mueve hacia la membrana, formando una nueva configuración única. El grupo β-fosfato de UDP giró casi 180 ° hacia el sitio de unión del aceptor desde el estado de carga de UDP-GlcNAc hasta el estado preparado (Fig. 3f). El β-fosfato rotado se estabiliza principalmente con Q756 y R759 (Fig. 3d). En particular, se identificaron dos iones Mg2+ para estabilizar el α-fosfato mediante una estrecha coordinación con E457 y D745 en la estructura Chs1 preparada, que es diferente de la unión relativamente floja de Mg2+ en el estado de carga de UDP-GlcNAc (Fig. 3d, e). . Estos hallazgos respaldan nuestra sugerencia anterior de que el resto GlcNAc de UDP-GlcNAc debe rotarse a una posición insertada para la formación de enlaces glicosídicos β (1 → 4).

Para confirmar qué producto de la hidrólisis de UDP-GlcNAc induce el cambio de bucle de conmutación, determinamos además dos mapas crio-EM de Chs1 incubados con GlcNAc o UDP con una resolución de 3,5 Å y 3,6 Å, respectivamente (Figura complementaria 9). Descubrimos que la primera estructura todavía estaba en el estado apo sin unión de GlcNAc, lo que sugiere que GlcNAc por sí sola no podía activar el bucle de conmutación (Figura 13 complementaria). Por el contrario, el bucle de conmutación fue activado solo por el producto UDP, como se muestra en la estructura Chs1 unida a UDP (Fig. 3b). El UDP también está en una configuración invertida, similar al UDP en estado preparado. En conjunto, los resultados sugieren el proceso de hidrólisis de UDP-GlcNAc en UDP, y la reconfiguración de UDP induce el cambio del circuito del interruptor y la apertura del camino desde el sitio activo al canal transmembrana.

El supuesto canal de transporte de quitina transmembrana de Chs1 está compuesto principalmente por TMH1, TMH3-4 y TMH6 y está ubicado directamente debajo del sitio activo (Fig. 4a, e). Estos TMH forman una cavidad en forma de embudo en la membrana, que se caracteriza por una parte superior hidrófila y una parte inferior hidrófoba (Fig. 4a, e). Hay numerosos residuos polares en la parte superior de la cavidad, incluidos E653, S657 y D661 de IF1; N801, S805 y S808 de TMH1; Y925, Y945 y S949 de IF3; y S1108 y R1112 de TMH6. El ambiente hidrófilo es más favorable para el alargamiento y transporte de la quitina. Por el contrario, la parte inferior de la cavidad está compuesta principalmente por residuos hidrofóbicos (Fig. 4e). Entre ellos, L819 de TMH1, M886 de TMH3, F911, I914, L918 de TMH4 y F1098 de TMH6 forman una puerta hidrofóbica cerrada, que impide que la cavidad se conecte con el lado exoplásmico. Posiblemente, la puerta hidrofóbica inferior deba abrirse durante la síntesis de quitina. Dos residuos polares cercanos a la puerta hidrófoba, S883 y S917, también parecen desempeñar papeles importantes durante este proceso, como se muestra en el ensayo de complementación del crecimiento in vivo del doble mutante S883F/S917F (Fig. 3c).

El extremo exoplásmico de TMH4 y su bucle adyacente que conecta TMH3 y TMH4 son muy flexibles, como lo indican sus débiles densidades en todos nuestros mapas crio-EM. Esto sugiere que TMH4 es móvil y que la dinámica probablemente corresponde a la apertura de la puerta hidrofóbica de Chs1 durante la síntesis de quitina. Para confirmar aún más esta hipótesis, llevamos a cabo un análisis de variabilidad 3D (3DVA) de la estructura Chs1 en el estado de carga UDP-GlcNAc. 3DVA es un software desarrollado recientemente en crioSPARC para revelar la variabilidad continua y la heterogeneidad discreta de una estructura36. Descubrimos que TMH4 se transforma de bien ordenado a desordenado en dos extremos y, en consecuencia, el canal de transporte de quitina se cierra y se abre (Fig. 4f, g, Película complementaria 1). Esto confirmó la flexibilidad de TMH4 en el mapa. También observamos que la densidad del bucle de intercambio de dominio se desordenó simultáneamente cuando la densidad de TMH4 se desordenó. En este estado, Chs1 tiene un canal de translocación de quitina abierto y no tiene un bucle de intercambio de dominio vinculado en GTD (Fig. 4g). Esto puede sugerir que la apertura del canal de translocación está correlacionada con la liberación de un bucle de intercambio inhibidor desde el dominio GTD.

La cavidad tiene una abertura lateral en el medio de la bicapa lipídica, que estaba formada por TMH3, TMH4 e IF3 (Figura complementaria 19). Además, se observan dos densidades alargadas horizontales llenando la cavidad desde la abertura lateral, y las densidades se asemejan a dos moléculas de esterol según sus formas. No está claro si las moléculas de esteroles están disponibles in vivo o se introducen durante la purificación, pero claramente necesitan difundirse fuera de la cavidad durante el transporte de quitina. También se encontraron lípidos similares en la estructura de la hialuronano sintasa16.

Las polioxinas y las nikkomicinas son antibióticos peptidil nucleósidos naturales. Con similitud estructural con UDP-GlcNAc, PolyB y NikkoZ, dos componentes principales de los inhibidores de peptidil nucleósidos, exhiben actividad antifúngica y antiinsectos al actuar como inhibidores competitivos de la quitina sintasa. Los restos de nucleósidos de PolyB y NikkoZ son el mismo ácido 5-aminohexurónico unido N-glicosídicamente al uracilo. Por el contrario, los restos peptidilo de PolyB contienen ácido carbamoilpolioxámico y NikkoZ contiene hidroxipiridilhomotreonina. Realizamos el ensayo de glicosiltransferasa UDP-Glo ​​in vitro con PolyB o NikkoZ en el tampón de reacción y descubrimos que la actividad de Chs1 se redujo en más del 80% (Fig. 1b, Fig. complementaria 3d).

Determinamos las estructuras de Chs1-PolyB y el complejo Chs1-NikkoZ con una resolución de 3,6 Å y 2,4 Å, respectivamente (Figuras complementarias 4, 10). La comparación entre los mapas de Chs1 en los estados unidos a apo y a inhibidor reveló densidades adicionales claramente alargadas correspondientes a PolyB y NikkoZ en el sitio activo, consistentes con su función como inhibidores competitivos de sustrato (Figura 13 complementaria). Los restos de nucleósidos de PolyB y NikkoZ están estabilizados por T453, M454, Y455 y K578 en la parte superior del sitio activo, que son los mismos residuos que interactúan con el grupo de nucleósidos de UDP-GlcNAc (Fig. 5a-d). Por el contrario, a diferencia del resto GlcNAc flexible de UDP-GlcNAc que se extiende fuera del sitio activo, los restos peptidilo de PolyB y NikkoZ se extienden hacia el canal de transporte de quitina y forman interacciones extensas con E457, D602, A677 y W760 (Fig. 5a-). d). La arquitectura única del resto peptidilo hace que el inhibidor se bloquee dentro del sitio activo de Chs1. Específicamente, NikkoZ tiene contactos adicionales con P675 y Q756 de Chs1 debido a su grupo más grande en el resto peptidilo que PolyB (Fig. 5c, d), lo que es consistente con hallazgos previos de que Nikkomicina tiene un Ki relativamente más bajo que las polioxinas26,37. Las interacciones únicas entre Chs1 y los restos peptidilo de PolyB y NikkoZ también indican la mayor afinidad de unión de estos inhibidores sobre el sustrato UDP-GlcNAc. Además, el bucle de conmutación de Chs1 está abierto en nuestras estructuras Chs1-PolyB y Chs1-NikkoZ. En particular, la parte terminal de los restos peptidilo de PolyB y NikkoZ ocupan el sitio de unión del aceptor de GlcNAc y, por lo tanto, bloquean el canal de transporte de quitina. Por lo tanto, nuestras estructuras sugieren que los inhibidores de peptidil nucleósidos inhiben las quitina sintasas utilizando un mecanismo único: el resto nucleósido compite con la unión de UDP, y el resto peptidilo induce la apertura del circuito de conmutación y bloquea la puerta del canal de transporte de quitina.

a Sitio de unión detallado de la polioxina B. Los residuos clave y la polioxina B se muestran en barras. b Esquema LIGPLOT para los residuos de unión de polioxina B de Chs1. c Sitio de unión detallado de Nikkomycin Z. Los residuos clave y la polioxina B se muestran en barras. d Esquema LIGPLOT para los residuos de unión a Nikkomicina Z de Chs1.

En este trabajo, revelamos por primera vez que la activación por proteólisis del zimógeno Chs1 se produce mediante la eliminación de su región N-terminal. Al determinar la estructura de Chs1 dimérico en los estados apo, carga de donante, preparado (unido a UDP + GlcNAc) y unido a donante + aceptor, pudimos proponer un modelo funcional de Chs1 activado (Fig. 6a). En el estado apo de Chs1, el supuesto sitio activo está abierto para la unión al donante, mientras que el supuesto canal de transporte de quitina está sellado por un bucle de interruptor en el lado citosólico y TMH4 en el lado exoplásmico. Luego, UDP-GlcNAc se une al sitio activo principalmente mediante su resto UDP, mientras que el resto GlcNAc es flexible para autocebarse. A continuación, la hidrólisis del donante activa el circuito del interruptor y abre la puerta desde el sitio activo al canal de transporte. La hidrólisis del donante genera una molécula de GlcNAc en el sitio de unión del aceptor con su hidroxilo C4 hacia el sitio activo. Después de eso, se libera UDP y la segunda molécula donante se une al sitio activo, como se muestra en el estado unido a UDP-GlcNAc+GlcNAc de Chs1. Proponemos además que la siguiente unión y recambio del sustrato genere un enlace glicosídico β (1 → 4) con el aceptor GlcNAc para formar un disacárido. La quitina se alarga repitiendo el proceso de unión e hidrólisis del donante. Finalmente, el TMH4 flexible se desplaza hacia afuera, abriendo el canal de transporte de quitina. El desplazamiento hacia abajo de GTD hacia la membrana durante la hidrólisis del donante puede ayudar a expulsar el producto. Los inhibidores de peptidil nucleósidos inhiben las quitina sintasas al ocupar los sitios de unión tanto del donante como del aceptor y bloquear el canal de transporte de quitina (Fig. 6b).

un Chs1 en estado apo tiene un sitio activo abierto y un canal transmembrana sellado por un bucle de conmutación y TMH4. La unión del donante de azúcar (UDP-GlcNAc) y la hidrólisis posterior prepararon la primera molécula aceptora (GlcNAc) en el sitio de unión. El proceso de cebado abre el canal de transporte de quitina en el lado citosólico al activar el circuito del interruptor y desencadena el movimiento descendente del dominio GT para expulsar el producto. Luego, se libera UDP y una nueva molécula donante se une al sitio activo para el alargamiento de la quitina. Para transportar el producto de quitina al exterior, TMH4 se desplaza hacia afuera, lo que da como resultado un canal abierto en el lado exoplásmico. Se proporcionan más detalles en el texto. b Los inhibidores de peptidil nucleósidos inhiben Chs1 compitiendo con la unión de UDP, ocupando el sitio de unión del aceptor de azúcar y bloqueando el canal de transporte de quitina. c El bucle de intercambio de dominio en una subunidad regula la actividad de la otra subunidad inhibiendo y liberando su GTD. Esto permite la síntesis de quitina de dos subunidades del dímero Chs1 simultáneamente y facilita la formación de fibras de quitina. Durante la síntesis de quitina, el circuito de conmutación y el TMH4 de cada subunidad se desplazan para abrir el canal de transporte de quitina.

El sitio activo y el canal de transporte de quitina de cada subunidad Chs1 en el dímero son independientes, pero el bucle de intercambio de dominio en una subunidad probablemente regula la función de la otra subunidad inhibiendo y liberando su GTD. Esto hace que la síntesis de quitina de las dos subunidades sea simultánea, lo que probablemente sea importante para la formación de fibras de quitina (Fig. 6c). Además, debido a que dos residuos de GlcNAc vecinos dentro de la cadena de quitina están en orientaciones alternas, estudios anteriores propusieron que la quitina sintasa posee dos sitios activos para cada orientación de azúcar38. Sin embargo, nuestra estructura de Chs1 mostró que cada subunidad solo tiene un sitio activo y dos sitios activos en el dímero Chs1 están demasiado lejos para cooperar entre sí. Se requiere más investigación para comprender completamente el mecanismo de elongación de Chs1 por quitina, incluida cómo conectar los residuos de GlcNAc en orientaciones alternas. La captura de Chs1 en complejo con quitina sin duda proporcionará más información sobre este modelo.

Las sintasas de quitina, hialuronano y celulosa pertenecen a la familia GT-2. La comparación estructural indicó que Chs1 comparte una similitud general con el hialuronano y las celulosa sintasas (Figuras complementarias 18a, b) 16,21, aunque sus detalles estructurales y su estado oligomérico son diferentes. Las sintasas de quitina, hialuronano y celulosa tienen un dominio de glicosiltransferasa citosólica similar y un canal de transporte de polisacáridos transmembrana. En particular, el resto GlcNAc del donante UDP-GlcNAc en complejo con HAS se enfrenta al sitio de unión del aceptor (Figura complementaria 18c, d), lo que respalda nuestra propuesta de que el resto GlcNAc de UDP-GlcNAc en Chs1 debe rotarse hacia adentro para obtener azúcar. transferir.

Durante la preparación de este manuscrito, otro grupo informó las estructuras crio-EM de la quitina sintasa 2 de Candida albicans (caChs2) en estados de apo, unido a UDP-GlcNAc, unido a nikkomicina Z y unido a polioxina D34. caChs2 y Chs1 de Saccharomyces cerevisiae (scChs1) en nuestro trabajo comparten una identidad de secuencia de ~ 50%. Las estructuras de caChs2 y scChs1 en cuatro estados diferentes son todas superponibles con una desviación cuadrática media (rmsd) de ~ 1,2 Å, lo que indica su alta similitud (Figura complementaria 20). La principal diferencia sustancial observada en la comparación estructural es que el motivo VLPGA conservado (bucle de conmutación) está cerrado en apo y scChs1 unido a UDP-GlcNAc, pero abierto en apo y caChs2 unido a UDP-GlcNAc. Esta diferencia probablemente se deba a la diferencia de especies o al diferente sistema de expresión utilizado en dos trabajos (scChs1 en S. cerevisiae BY4742; caChs2 en la célula de insecto sf9). Además, el sustrato UDP-GlcNAc y dos tipos de inhibidores están unidos en posiciones similares en las estructuras de caChs2 y scChs1, lo que sugiere sus mecanismos catalíticos e inhibidores similares. Debido a la falta de estructuras en los estados cebado y unido a UDP-GlcNAc + GlcNAc, en el trabajo de caChs2 no se descubrió el ciclo catalítico detallado de la quitina sintasa ni la regulación del canal de transporte de quitina por TMH4. La función inhibidora del bucle de intercambio de dominio tampoco se definió en ese trabajo.

En conclusión, nuestros estudios sistemáticos estructurales y bioquímicos de Chs1 han proporcionado conocimientos profundos sobre los mecanismos moleculares para la activación de la proteólisis, la actividad glicosiltransferasa y el transporte transmembrana de quitina de una quitina sintasa fúngica, y los mecanismos inhibidores de dos inhibidores de peptidil nucleósido quitina sintasa. Dado el papel fundamental de la quitina sintasa en las infecciones por hongos patógenos, nuestro trabajo proporciona una plataforma para el desarrollo de nuevas moléculas antifúngicas pequeñas.

Etiquetamos Chs1 (Uniprot ID: P08004) con un triple FLAG C-terminal en el vector pRS423 modificado (Tabla complementaria 2). La cepa de levadura BY4742 se transformó y se cultivó en medio sintético sin histidina (SD-His) durante aproximadamente 20 h y luego se transfirió a medio YPG (10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de D-galactosa por litro) durante 12 h. antes de la cosecha. Las células se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,4, sorbitol 0,2 M, acetato de potasio 50 mM, EDTA 2 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM y luego se lisaron usando una prensa francesa a 15.000 psi. Centrifugamos el lisado a 10.000 × g durante 30 min a 4 ° C y recogió el sobrenadante para otro ciclo de centrífuga a 100.000 × g durante 60 min a 4 ° C. El sedimento de membrana se recogió y luego se resuspendió en tampón A que contenía glicerol al 10%, Tris-20 mM. HCl (pH 7,4), DDM al 1%, hidrogenosuccinato de colesterol (CHS) al 0,1%, NaCl 500 mM, MgCl2 1 mM, EDTA 1 mM y PMSF 1 mM. Después de la incubación durante 30 minutos a 4 °C, la mezcla se centrifugó. durante 30 min a 100.000 × g para eliminar la membrana insoluble. Cargamos el sobrenadante en una columna de afinidad anti-FLAG (M2) preequilibrada (GenScript) a 4 ° C y lavamos el gel de afinidad con tampón B (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, lauril maltosa neopentilglicol (LMNG) al 0,01%, GDN al 0,0033%, CHS al 0,0013% y MgCl2 1 mM). Las proteínas se eluyeron con tampón B que contenía 0,15 mg/ml de péptido FLAG 3 × y se analizaron adicionalmente. se purificó en una columna de filtración en gel de aumento Superose 6 10/300 en tampón C (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, LMNG 0,001 %, GDN 0,00033 %, CHS 0,00013 % y MgCl2 1 mM). Las proteínas purificadas se evaluaron mediante SDS‒PAGE y se concentraron para el análisis crio-EM. Examinamos una variedad de detergentes en la purificación y descubrimos que LMNG/GDN/CHS es el mejor detergente para preparar la rejilla crio-EM, y DDM/CHS es el mejor para la estabilidad y el rendimiento de Chs1. Para simplificar el experimento, se utilizó una muestra purificada con DDM/CHS en los ensayos de actividad.

Para capturar diferentes estados, se usó Chs1 purificado para la preparación de la rejilla EM directamente o se mezcló con diferentes sustratos (UDP-GlcNAc 5 mM, GlcNAc 5 mM o UDP 5 mM) o inhibidores (Nikkomicina Z 5 mM o Polioxina B 5 mM) en hielo. . Después de la incubación, se colocaron alícuotas de 2,5 μl de Chs1 a una concentración de ~3 mg/mL en rejillas de carbón perforado con descarga luminosa (Quantifoil Au R1.2/1.3, malla 300) y se congelaron instantáneamente en etano líquido usando un FEI Vitrobot. Marco IV. Las rejillas se examinaron en un microscopio electrónico FEI TF30 de 300 keV de la Facultad de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad de Pekín. Los datos Cryo-EM se recopilaron automáticamente con SerialEM en un microscopio electrónico FEI Titan Krios de 300 keV de la Facultad de Física de la Universidad de Pekín y el Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias con valores de desenfoque que oscilan entre −1,2 y −2,5 μm. El microscopio se operó con un detector directo K3 con un aumento nominal de 225.000 ×. Las dosis totales fueron de 50 a 60 electrones por Å2 a nivel de muestra.

Utilizamos el programa MotionCorr-2.039 para la corrección del movimiento y CTFFIND-4.140 para el cálculo de los parámetros de la función de transferencia de contraste. Usamos RELION-3 para la recolección y extracción de partículas y usamos CryoSPARC para todos los pasos restantes36,41. La resolución de los mapas se estimó mediante la correlación de capa de Fourier estándar de oro con un valor de corte de correlación de 0,143.

Para la estructura Chs1 unida a Nikkomycin Z, recopilamos 2711 micrografías de película sin procesar. Se seleccionaron automáticamente un total de 4.135.734 partículas para su clasificación 2D y refinamiento heterogéneo. Según la calidad de tres mapas 3D refinados heterogéneos, se retuvieron 837.015 partículas para su posterior refinamiento y posprocesamiento, lo que dio como resultado un mapa 3D de resolución promedio de 2,4 Å utilizando simetría C2.

Para la estructura Chs1 en estado apo, recopilamos 3672 micrografías de película sin procesar. Se seleccionaron automáticamente un total de 3.529.578 partículas para clasificación 2D y refinamiento heterogéneo. Según la calidad de tres mapas 3D refinados heterogéneos, se retuvieron 1.342.168 partículas para su posterior refinamiento y posprocesamiento, lo que dio como resultado un mapa 3D de resolución promedio de 3,0 Å utilizando simetría C2.

Para la estructura Chs1 unida a UDP-GlcNAc + GlcNAc, recopilamos 1252 micrografías de película sin procesar. Se seleccionaron automáticamente un total de 996.080 partículas para su clasificación 2D y refinamiento heterogéneo. Según la calidad de tres mapas 3D refinados heterogéneos, se retuvieron 208.320 partículas para su posterior refinamiento y posprocesamiento, lo que dio como resultado un mapa 3D de resolución promedio de 3,1 Å utilizando simetría C2.

Para la estructura Chs1 unida a UDP-GlcNAc, recopilamos 1076 micrografías de película sin procesar. Se seleccionaron automáticamente un total de 1.036.417 partículas para su clasificación 2D y refinamiento heterogéneo. Según la calidad de tres mapas 3D refinados heterogéneos, se retuvieron 330.289 partículas para su posterior refinamiento y posprocesamiento, lo que dio como resultado un mapa 3D de resolución promedio de 3,1 Å utilizando simetría C2.

Para la estructura Chs1 unida a UDP + GlcNAc (estado preparado), recopilamos 2469 micrografías de película sin procesar. Se seleccionaron automáticamente un total de 1.059.472 partículas para su clasificación 2D y refinamiento heterogéneo. Según la calidad de tres mapas 3D refinados heterogéneos, se retuvieron 184.449 partículas para su posterior refinamiento y posprocesamiento, lo que dio como resultado un mapa 3D de resolución promedio de 3,1 Å utilizando simetría C2.

Para la estructura Chs1 vinculada a UDP, recopilamos 632 micrografías de película sin procesar. Se seleccionaron automáticamente un total de 431.546 partículas para su clasificación 2D y refinamiento heterogéneo. Según la calidad de tres mapas 3D refinados heterogéneos, se retuvieron 115.773 partículas para su posterior refinamiento y posprocesamiento, lo que dio como resultado un mapa 3D de resolución promedio de 3,6 Å utilizando simetría C2.

Para la estructura Chs1 en estado apo después de la incubación con GlcNAc, recolectamos 1564 micrografías de película sin procesar. Se seleccionaron automáticamente un total de 1.077.654 partículas para su clasificación 2D y refinamiento heterogéneo. Según la calidad de tres mapas 3D refinados heterogéneos, se retuvieron 218.698 partículas para su posterior refinamiento y posprocesamiento, lo que dio como resultado un mapa 3D de resolución promedio de 3,5 Å utilizando simetría C2.

Para la estructura Chs1 unida a polioxina B, recopilamos 2311 micrografías de película sin procesar. Se seleccionaron automáticamente un total de 2.608.153 partículas para su clasificación 2D y refinamiento heterogéneo. Según la calidad de tres mapas 3D refinados heterogéneos, se retuvieron 142.887 partículas para su posterior refinamiento y posprocesamiento, lo que dio como resultado un mapa 3D de resolución promedio de 3,6 Å utilizando simetría C2.

Utilizamos la estructura Chs1 predicha por Alphafold2 como modelo inicial42,43, la ajustamos a nuestro mapa y la corregimos en COOT44 y Chimera45. El modelo Chs1 completo fue refinado mediante refinamiento en espacio real en el programa PHENIX46 y posteriormente ajustado manualmente en COOT. Finalmente, el modelo fue validado utilizando MolProbity47. Las figuras estructurales se prepararon en Chimera y PyMOL (https://pymol.org/2/).

La actividad de Chs1 se midió utilizando el ensayo de glicosiltransferasa UDP-Glo™ de Promega (catálogo: V6961), que puede medir la actividad de cualquier glicosiltransferasa (GT) que utilice un azúcar UDP como sustrato. Cada reacción contenía 0,125 μg de proteína purificada, HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, DDM al 0,025 %, CHS al 0,0025 % y MgCl2 10 mM, GlcNAc 10 mM y UDP-GlcNAc 10 mM en un volumen total de 5 μL. La mezcla se incubó primero durante 60 minutos a 30 °C y luego se agregaron 5 µl de reactivo de detección UDP. La mezcla se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente y luego se detectó la luminiscencia mediante un lector de microplacas multimodo híbrido Synergy H1 (BioTek).

La actividad de la quitina sintasa se evaluó utilizando el método descrito por Lucero con algunas modificaciones27. El ensayo incluye principalmente dos pasos: unión de quitina sintetizada a una superficie recubierta de WGA y detección del polímero con un conjugado de peroxidasa de rábano picante-WGA. La actividad de la peroxidasa de rábano picante se puede determinar en absorbancia a 600 nm y los valores se convierten en cantidades de quitina utilizando quitina comercial como estándar. En primer lugar, se recubrieron previamente los pocillos de placas de 96 pocillos con WGA (aglutinina de germen de trigo). Luego, se agregaron 100 µl de solución de reacción que contenía 3,4 µg de proteína purificada, HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, DDM al 0,025 %, CHS al 0,0025 %, MgCl2 1 mM, GlcNAc 2 mM y UDP-GlcNAc 1 mM y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente. Después de retirar la solución de los pocillos, se añadieron a cada pocillo 100 µl de WGA-HRP (aglutinina de germen de trigo - peroxidasa rojiza de caballo) a una concentración de 1 µg/ml en solución tampón (HEPES 0,2 mM a pH 7,4) y se cultivaron a 37°C durante 20 min. Luego, se eliminó la solución de los pocillos y los pocillos se lavaron con solución tampón tres veces. A cada pocillo, se agregaron 100 µl de solución de sustrato 1-Step Ultra TMB-ELISA y las mezclas se hicieron reaccionar lúcidamente durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, todas las reacciones se detuvieron con 100 μl de H2SO4 0,5 M y los espectros de absorción UV-Vis se registraron en un lector de microplacas a 450 nm mediante un lector de microplacas multimodo híbrido Synergy H1 (BioTek).

En primer lugar, las bandas de proteínas en gel SDS-PAGE se cortaron y procesaron mediante digestión en gel. Después de descolorarlas y alquilarlas reductivamente, las piezas de gel se incubaron con 500 ng de tripsina en 100 µl de NH4HCO3 50 mM durante la noche a 37 °C. A continuación, los péptidos digeridos con tripisna se eluyeron del gel y se secaron al vacío. Los experimentos de nano-LC-MS/MS se realizaron luego utilizando un espectrómetro de masas LTQ orbitrap velos pro (Thermo Electron, Bremen, Alemania). Cada muestra se cargó en una columna de fase inversa C18 (Thermo Electron, Bremen, Alemania). Las mezclas de péptidos se eluyeron con un gradiente de 0-40 % (tampón A, 0,1 % de ácido fórmico, tampón B, 0,1 % de ácido fórmico y 100 % de ACN) durante 60 minutos y se detectaron en un espectrómetro de masas utilizando un método TOP10 dependiente de los datos. Las condiciones generales de espectrometría de masas fueron: voltaje de pulverización, 2,2 kV; sin vaina y flujo de gas auxiliar; temperatura del tubo de transferencia de iones a 250 °C; 35% de energía de colisión normalizada utilizada para MS/MS(MS2). Los umbrales de selección de iones fueron 1000 cuentas para MS2. En las adquisiciones de MS2 se aplicó una activación q = 0,25 y un tiempo de activación de 30 ms. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de iones positivos y se empleó un cambio automático dependiente de los datos entre los modos de adquisición MS y MS/MS. Para cada ciclo, un escaneo MS completo en Orbitap seguido de diez MS2 en LTQ en los diez iones más intensos. Los iones seleccionados se excluyeron de una selección adicional durante 30 s. Los datos finales de LC-MS/MS se enviaron a una búsqueda en la base de datos en la biblioteca de secuencias de S. cerevisiae en la base de datos de secuencias de proteínas Uniprot utilizando el algoritmo Sequest HT en el paquete de software Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific).

La quitina insoluble se sintetizó siguiendo el ensayo de síntesis de quitina anterior y se recogió mediante centrifugación. La quitina se lavó y se resuspendió con tampón (NaH2PO4 50 mM, pH 6,0). Se añadió quitinasa (C6137, Sigma, 0,5 mg/ml) y se incubó a 37°C durante 24 h.

Preparamos la cepa knockout de Chs1 (ΔChs1) en la cepa W303 (Tabla complementaria 2). Mutantes y truncamientos de Chs1 (N456A/E457A, K578A, D602A, S657F/N658F, K662M, V673S, L674Q, P675L, P675T, G676L, R718L, D745R, E752R, Q756L, R759A, W760A, S88 3F/S917F y Δ975-1024) se construyeron utilizando el plásmido pRS423-His3 y se transformaron en la cepa ΔChs1 (Tabla complementaria 2). Las células primero se cultivaron hasta el mismo valor de DO de 1,0 en medio SD a 30 °C. La microscopía se realizó con un microscopio invertido OLYMPUS CKX53 con un aumento de 400 ×. La adquisición y análisis de imágenes se realizaron con el programa ToupView 3.7. Las imágenes microscópicas mostradas de las muestras control y knockout/mutantes se ajustaron por igual utilizando los mismos valores de brillo y contraste. Las células de levadura se lavaron brevemente con agua y se tomaron imágenes inmediatamente en agua a temperatura ambiente.

El blanco de calcoflúor (CFW) es una tinción de fluorocromo no específica para polisacáridos con enlaces 1,3-β y 1,4-β y muestra fluorescencia cuando se expone a luz ultravioleta de longitud de onda larga. La tinción de quitina sintetizada por CFW se realizó mediante una modificación del procedimiento anterior28,29,30. Preparamos 20 μL de solución de reacción que contiene 3 μg de proteína purificada, HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, DDM al 0,025%, CHS al 0,0025%, MgCl2 1 mM, GlcNAc 2 mM y UDP-GlcNAc 2 mM y se incuba durante 0, 1 y 24 h, respectivamente a 30 °C. Finalmente, se añadió EDTA 10 mM a la solución de reacción para detener la reacción. Para visualizar la quitina sintetizada, colocamos 3 μl de la solución de reacción en un portaobjetos de vidrio limpio, luego agregamos 3 μl de tinte blanco de calcoflúor y un volumen igual de hidróxido de potasio al 10%, cubrimos la muestra con un cubreobjetos y dejamos que absorba el tinte durante 1 minuto. Finalmente, la quitina teñida se detectó utilizando un microscopio de fluorescencia de investigación invertido automatizado Leica DMI4000 B bajo rayos ultravioleta con un aumento de x200-x400. La adquisición y análisis de imágenes se realizaron con el programa Leica Application Suite X.

Blue Native PAGE se llevó a cabo en condiciones no desnaturalizantes en geles (1,0 mm de espesor) que contenían entre 4 y 15 % de poliacrilamida. Se llevó a cabo en tampón de electroforesis PAGE Blue Native (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.) a 100 V durante 15 h.

SDS‒PAGE se realizó por primera vez en geles (1,0 mm de espesor) que contenían entre 4 y 12 % de poliacrilamida. Luego se transfirieron las proteínas en gel SDS‒PAGE a una membrana de fluoruro de polivinilideno. Se utilizaron anticuerpo monoclonal de ratón anti-Flag (Abcam, catálogo: ab125243, clon: FG4R) e IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP (H + L) (Proteintech, catálogo: SA00001-1) para la transferencia a 1:1000 y 1: Relación de dilución de 5000 respectivamente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas crio-EM 3D y los correspondientes modelos atómicos de Chs1 se han depositado en la base de datos EMDB y en la RCSB PDB con los respectivos códigos de acceso EMD-36856 y 8K3Q (estado apo), EMD-36857 y 8K3R (estado apo incubado con GlcNAc) , EMD-36863 y 8K3W (estado unido UDP-GlcNAc+GlcNAc), EMD-36862 y 8K3V (estado unido UDP-GlcNAc), EMD-36861 y 8K3U (estado unido UDP+GlcNAc preparado), EMD-36859 y 8K3T (UDP estado enlazado), EMD-36855 y 8K3P (estado enlazado PolyB) y EMD-36864 y 8K3X (estado enlazado NikkoZ). Se puede acceder a otros modelos utilizados para el análisis en este artículo en la base de datos RCSB PDB con sus respectivos códigos de acceso: HAS unido a UDP-GlcNAc (ID de PDB: 7SP8), CesA (ID de PDB: 7D5K) y Candida albicans Chs2 en apo (ID de PDB). : 7STL), estados unidos a UDP-GlcNAc (ID de PDB: 7STM), unidos a NikkoZ (ID de PDB: 7STN) y unidos a polioxina (ID de PDB: 7STO). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Los datos de Cryo-EM se recopilaron en la plataforma Cryo-EM del Centro de Imágenes Biológicas (CBI, cbi.ibp.ac.cn) del Instituto de Biofísica de la Academia China de Ciencias y del Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad de Pekín. Agradecemos a Xuemei Li, Zhenxi Guo, Boling Zhu, Xujing Li y Xiaojun Huang por facilitar la recopilación de datos. Agradecemos a Kailong Li y Qing Li de la Universidad de Pekín por proporcionar instrumentos y materiales experimentales. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32171212 a LB, No. 32071207 a CY), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (a LB), la Universidad de Pekín (a LB), el Fondo Nacional de Investigación Básica Programa de China (Programa 973, No. 2012CB917202 a CY).

Estos autores contribuyeron igualmente: Dan-Dan Chen, Zhao-Bin Wang.

Departamento de Bioquímica y Biofísica, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Pekín, Beijing, China

Dan-Dan Chen, Zhao-Bin Wang, Le-Xuan Wang, Peng Zhao, Cai-Hong Yun y Lin Bai

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DC, ZW, CY y LB concibieron y diseñaron los experimentos. DC, ZW, LW, PZ y LB realizaron los experimentos. DC, ZW, CY y LB analizaron los datos. LB escribió el manuscrito con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Cai-Hong Yun o Lin Bai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Jochen Zimmer y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Chen, DD., Wang, ZB., Wang, LX. et al. Estructura, catálisis, transporte de quitina e inhibición selectiva de la quitina sintasa. Nat Comuna 14, 4776 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40479-4

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Recibido: 11 de agosto de 2022

Aceptado: 28 de julio de 2023

Publicado: 08 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40479-4

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