Aclarando el mecanismo de Weissella

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 17128 (2015) Citar este artículo

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El mecanismo por el cual las bacterias del ácido láctico prolongan la vida útil de Caenorhabditis elegans ha sido dilucidado previamente. Sin embargo, aún no se ha estudiado el papel de las especies de Weissella. Mostramos que Weissella koreensis y Weissella cibaria extienden significativamente (p < 0,05) la vida útil de C. elegans en comparación con Escherichia coli OP50 e inducen la expresión de varios genes relacionados con la extensión de la vida útil (daf-16, aak-2, jnk-1, sod-3 y hif-1). La administración oral de Weissella alteró la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), redujo la acumulación de lipofuscina y aumentó la actividad locomotora (lo que se traduce en un retraso en el envejecimiento). Además, C. elegans alimentado con Weissella tenía tamaños corporales, tamaños de cría, niveles de ATP y tasas de bombeo faríngeo reducidos en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50. Además, las mutaciones en sod-3, hif-1 o skn-1 no alteraron la extensión de la vida en comparación con C. elegans de tipo salvaje. Sin embargo, C. elegans no logró mostrar una extensión de la vida útil en mutantes con pérdida de función de daf-16, aak-2 y jnk-1, lo que resalta el papel potencial de estos genes en la longevidad inducida por Weissella en C. elegans. Las especies de Weissella extienden la vida útil de C. elegans activando DAF-16 a través de la vía de la quinasa N-terminal (JNK) c-Jun, que está relacionada con la respuesta al estrés y la vía de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) que se activa mediante restricción dietética .

Las especies de Weissella son bacterias del ácido láctico que recientemente han sido clasificadas como un nuevo género. Las especies de Weissella se encuentran en alimentos fermentados, incluidos los vegetales fermentados tradicionales coreanos y el kimchi, la caña de azúcar y el tracto intestinal de humanos y otros animales1. Los alimentos fermentados, incluido el kimchi, poseen diversas bacterias del ácido láctico, cuya composición afecta la fermentación y las propiedades sensoriales del kimchi2. El kimchi es un alimento probiótico muy conocido, con beneficios para la salud similares a los del yogur probiótico. Además, el kimchi tiene una variedad de otros beneficios para la salud que incluyen la promoción de la salud del cerebro, la piel y el colorrectal, así como el fortalecimiento del sistema inmunológico; se ha demostrado que el kimchi es eficaz contra el cáncer, la obesidad, el estreñimiento y el colesterol alto; también tiene propiedades fibrolíticas, antioxidantes y antienvejecimiento3. Recientemente, las especies de Weissella fueron identificadas como uno de los principales fermentadores del kimchi2. Las especies de Weissella son más resistentes a condiciones ácidas y anaeróbicas en comparación con las especies de Leuconostoc4. Weissella también tiene puentes interpeptídicos inusuales en la capa de peptidoglicano que distinguen a estas bacterias de otros lactobacilos5. Sin embargo, a diferencia de otras bacterias del ácido láctico, los posibles efectos beneficiosos de Weissella spp. en humanos requieren más estudios.

Caenorhabditis elegans es un pequeño nematodo del suelo de vida libre que se utiliza en diversos campos de investigación. C. elegans es un modelo particularmente útil para estudiar el envejecimiento debido a su corta vida útil y al hecho de que es susceptible de análisis genéticos6. Proporcionar bacterias de ácido láctico como fuente de alimento en lugar de E. coli OP50 aumenta la esperanza de vida promedio de C. elegans7,8,9. Varios estudios han descrito los mecanismos por los cuales las bacterias del ácido láctico extienden la vida útil de C. elegans, pero el papel de las especies de Weissella sigue siendo desconocido. Lactobacillus rhamnosus extiende la vida útil de C. elegans modulando la vía de señalización DAF-2/DAF-1610 y facilita la resistencia al estrés oxidativo en C. elegans, como lo demuestra la mayor supervivencia de C. elegans ante el estrés inducido por H2O2. Bifidobacterium infantis prolonga la vida útil de C. elegans mediante la activación de skn-1 (que está regulado por la vía p38 MAPK) de manera dosis dependiente; este efecto no fue inducido por la restricción dietética, lo que significa que B. infantis no promovió la longevidad mediante la activación del sistema de defensa del huésped a través de DAF-169. Se ha demostrado que la restricción dietética prolonga la vida útil de los animales, incluidos los humanos11; sin embargo, esto sigue siendo controvertido12. No está claro si las bacterias del ácido láctico inducen una restricción dietética, extendiendo así la vida útil de C. elegans. La restricción dietética puede regular la vida útil de C. elegans a través de las vías de señalización de insulina/IGF-1 (IIS) y de la diana de rapamicina (TOR)13. Estas vías (y otras) inducen el factor de transcripción DAF-16/FOXO14, que a su vez regula varios genes implicados en la regulación de la longevidad, la respuesta al estrés, el metabolismo y el desarrollo. Por lo tanto, DAF-16/FOXO es indispensable en la resistencia al estrés y en la regulación de la vida útil15. Además, JNK-1 está asociado con la respuesta al estrés en los vertebrados y es un regulador positivo de DAF-16. Además, AAK-2, el homólogo de AMPK en C. elegans, participa en la activación de DAF-16/FOXO y promueve la longevidad durante períodos de restricción de glucosa16.

En este estudio, investigamos si las especies de Weissella extienden la vida útil de C. elegans. También realizamos un ensayo de atracción de C. elegans hacia especies de Weissella y E. coli OP50. Para dilucidar el mecanismo subyacente a la extensión de la vida útil mediada por Weissella en C. elegans, se midió la vida útil de los gusanos utilizando mutantes con pérdida de función.

La alimentación de nematodos en un césped de W. koreensis o W. cibaria aumentó significativamente (p <0,001) la esperanza de vida media (MLS) de los gusanos en comparación con el grupo alimentado en el césped de E. coli OP50 (Tabla 1). W. koreensis fue más eficaz que W. cibaria para aumentar la MLS de lombrices. Las tasas de supervivencia de los gusanos fueron mayores tanto en los gusanos alimentados con W. cibaria como en los alimentados con W. koreensis en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50 después de 13 días (Fig. 1). Los datos completos sobre la vida útil de C. elegans de tipo salvaje y mutante se proporcionan en la Tabla S1.

El efecto de Weissella sobre la vida útil de C. elegans (N2).

Después de ser alimentados en un césped de E. coli OP50 durante 3 días, los gusanos adultos jóvenes se transfirieron a una placa mNGM nueva cubierta con césped de E. coli OP50, W. koreensis o W. cibaria; ***p < 0,001.

Para determinar el efecto de Weissella sobre la producción de ROS en C. elegans, se midieron los niveles totales de ROS de gusanos alimentados con E. coli OP50 o Weissella. Las dos especies de Weissella mostraron efectos opuestos con respecto a la producción de ROS (Fig. S1), con niveles de ROS un 43,7% más bajos y un 37,5% más altos en C. elegans alimentados con W. koreensis y W. cibaria, respectivamente, en comparación con C. elegans alimentados con E. coli OP50.

Los cambios relacionados con la edad en C. elegans incluyen cambios en el movimiento corporal, la tasa de bombeo faríngeo y el tamaño corporal. La acumulación de lipofuscina (un biomarcador del envejecimiento) puede determinarse mediante autofluorescencia, pero existe una considerable variación interindividual en los niveles de lipofuscina en C. elegans de la misma edad17. Descubrimos que la autofluorescencia disminuyó significativamente en los gusanos alimentados con Weissella en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50 (Fig. 2). Aunque la fluorescencia de la lipofuscina fue significativamente mayor el día 14 en el grupo alimentado con E. coli OP50 en comparación con cualquiera de los grupos alimentados con Weissella, ninguno de los tres grupos mostró grandes volúmenes de lipofuscina. Para el día 16, los niveles de lipofuscina en los grupos de W. koreensis y W. cibaria eran 35,1% y 22,9%, respectivamente, del nivel observado en el grupo de E. coli OP50. Después de 18 días, los niveles de lipofuscina en los grupos W. koreensis y W. cibaria aumentaron al 86,9 % y 75,3 %, respectivamente, de los observados en E. coli OP50.

Acumulación de lipofuscina en C. elegans (N2) alimentada con E. coli OP50, W. koreensis y W. cibaria.

(a) Fluorescencia de lipofuscina en gusanos alimentados con E. coli OP50, W. koreensis y W. cibaria los días 14, 16 y 18. Barra de escala = 100 μm. (b) La fluorescencia se cuantificó utilizando el software ImageJ. El gráfico representa el porcentaje medio en unidades arbitrarias en relación con el de los gusanos de control alimentados con E. coli OP50 el día 14. Se utilizaron diez gusanos para cada medición; **p<0,01, ***p<0,001.

Medimos la tasa de locomoción de C. elegans los días 4, 7, 10, 13 y 16 y encontramos que la proporción de gusanos que mostraban locomoción sinusoidal (clase A) era mayor en los gusanos alimentados con Weissella en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50 ( Fig. 3). El tamaño corporal aumentó con la edad en todos los grupos; sin embargo, los gusanos alimentados con Weissella eran más pequeños que los gusanos alimentados con E. coli (Fig. 4a). Mientras tanto, el tamaño de la cría fue menor en los gusanos alimentados con Weissella en comparación con el grupo de control (Fig. 4b). Curiosamente, los períodos reproductivos en los grupos alimentados con Weissella fueron ligeramente más largos en comparación con los del grupo alimentado con E. coli OP50. El tamaño total medio de las crías para cada par de gusanos fue 237, 84 y 74 en gusanos alimentados con E. coli OP50, W. koreensis y W. cibaria, respectivamente.

La actividad locomotora de C. elegans (N2) alimentó a E. coli OP50 o Weissella.

Los gusanos en etapa L4 alimentados con E. coli OP50 durante 3 días después de la eclosión se transfirieron a placas mNGM frescas con 20 mg de E. coli OP50 o césped de Weissella. Los nematodos se clasificaron en cuatro clases según su locomoción: clase (A) locomoción sinusoidal coordinada normal; clase (B) movimiento descoordinado y/o lento; clase (C) ningún movimiento excepto la cabeza o la cola en respuesta a un empujón; y gusanos muertos de clase (D). Las barras indican la proporción de cada clase en el horario designado.

Influencia de Weissella en el tamaño corporal y el tamaño de cría de C. elegans (N2).

(a) C. elegans en etapa L4 se transfirió a placas mNGM frescas sembradas con cada especie bacteriana el día 3 y se determinó el tamaño corporal a partir de 20 gusanos para cada especie bacteriana. (b) El tamaño total de la cría se determinó a partir de 30 animales y los valores representan la media para cada par de gusanos. Las diferencias significativas mostradas son relativas a E. coli OP50 (*p < 0,05, ***p < 0,001).

Luego determinamos el nivel de ingesta de alimentos midiendo la tasa de bombeo faríngeo. La reducción de la tasa de bombeo faríngeo puede inducir una restricción dietética al limitar la alimentación (similar a lo que ocurre en los mutantes eat-2)18. La tasa de bombeo se midió 30 minutos después de transferir los gusanos a placas de E. coli OP50 o Weissella contando el número de contracciones en el bulbo terminal de la faringe (Fig. 5a) durante 1 minuto. La tasa de bombeo de las lombrices cultivadas en el césped de Weissella disminuyó significativamente (p <0,05) después de 3 días (Fig. 5b). Luego se midió la tasa de bombeo cada 24 h desde el día 4 al día 10, durante el cual la tasa de bombeo del grupo Weissella fue menor que la del grupo E. coli (Fig. 5c). Independientemente de la especie bacteriana, la tasa de bombeo disminuyó con la edad.

La tasa de bombeo faríngeo de C. elegans (N2) alimentó a E. coli OP50 y Weissella.

La tasa de bombeo se midió en el bulbo terminal (a). La barra de escala representa 50 μm. (b) La tasa de bombeo de gusanos de 3 días, medida durante 30 minutos después de que los gusanos fueron transferidos a una placa mNGM nueva sembrada con cada especie bacteriana. (c) La tasa de bombeo en gusanos envejecidos, determinada a partir de la media de 20 gusanos para cada especie bacteriana. Las diferencias significativas mostradas son relativas a E. coli OP50 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Debido a que el nivel de ATP está relacionado con la restricción dietética19 así como con la vía AMPK, medimos los niveles de ATP y encontramos que los gusanos alimentados con W. koreensis y W. cibaria tuvieron una disminución del 23,4% y el 87,0% en ATP, respectivamente, en comparación con los gusanos alimentados con E. .coli OP50 (Fig. S2). Por lo tanto, Weissella afecta significativamente el contenido de ATP en C. elegans, especialmente en W. cibaria, lo que disminuyó drásticamente la producción de ATP.

Se sabe que C. elegans muestra preferencias por cepas bacterianas específicas20. Se realizó un ensayo de quimiotaxis para demostrar que el efecto de extensión de la vida útil de Weissella no se derivaba de una preferencia entre E. coli OP50 y Weissella. Los resultados mostraron que C. elegans parecía preferir E. coli OP50 a Weissella 30 minutos después de alimentar las cepas de prueba; sin embargo, la cantidad de gusanos en el círculo (ver Fig. S3) alrededor de E. coli OP 50 o Weissella fue similar (más de 300 gusanos) en cada prueba a los 60 minutos después de alimentar las cepas de prueba, lo que significa que C. elegans no no muestra ninguna preferencia entre E. coli OP50 y Weissella a los 60 minutos (Tabla S2). Curiosamente, muchos gusanos parecieron preferir el ácido láctico (125,0 ± 4,00) a los 30 minutos después de alimentarse de los compuestos de prueba y, nuevamente, el número de gusanos en el círculo fue similar (más de 300 gusanos) en cada prueba a los 60 minutos después de alimentarse de los compuestos de prueba. ácido láctico o etanol al 95%.

Investigamos la expresión de genes relacionados con la edad, incluidos los implicados en la restricción de la dieta en C. elegans, para determinar el mecanismo de extensión de la esperanza de vida en C. elegans alimentado con Weissella. Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (qRT) en los genes que se muestran en la Tabla S3. En los gusanos alimentados con Weissella, daf-16, sod-3, jkk-1, jnk-1 y aak-2 se sobreexpresaron significativamente (Fig. S4), especialmente en los gusanos alimentados con W. cibaria, donde todos los genes excepto daf-2 fueron aumentó más de dos veces, con daf-16 y sod-3 aumentaron 3,9 veces y 2,3 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de control OP50 de E. coli. Mientras tanto, en el grupo de W. koreensis aumentó la expresión de daf-16, sod-3, jkk-1, jnk-1 y aak-2, pero en menor medida que el grupo de W. cibaria y no hubo aumentos significativos en daf. Expresión -2 y hif-1. Los otros genes observados en este estudio no mostraron aumentos significativos en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50 (Fig. S4).

Analizamos la localización nuclear de DAF-16 mediante el uso de cepas transgénicas que expresan la proteína de fusión DAF-16 :: GFP (Fig. 6b). Las especies de Weissella indujeron un aumento de la translocación nuclear de DAF-16::GFP (E. coli OP50: 22,4%; W. koreensis: 73,3%; W. cibaria: 75,0%) y una reducción de la fracción citosólica de DAF-16::GFP (E. coli OP50: 41,5%; W. koreensis: 6,7%; W. cibaria: 9,4%) (Fig. 6c).

Las especies de Weissella indujeron la translocación nuclear de DAF-16::GFP.

(a) Dependiendo del grado de fluorescencia nuclear de GFP, se pueden distinguir tres estados diferentes de translocación de DAF-16::GFP desde el citoplasma a los núcleos celulares: citosólico (cyt, izquierda; sin fluorescencia nuclear de GFP), intermedio (int, centro; fluorescencia nuclear débil de GFP) y nuclear (nuc, derecha; fluorescencia nuclear fuerte de GFP) DAF-16::localización de GFP. (b) Imágenes representativas de la cepa transgénica CF1407 alimentada con E. coli OP50 (izquierda), W. koreensis (centro) y W. cibaria (derecha). Barra de escala = 20 μm. (c) Localización nuclear de DAF-16 por especies de Weissella. Los valores mostrados son la media ± DE de 90 gusanos para cada especie bacteriana. Las diferencias significativas mostradas son relativas a E. coli OP50 (**p < 0,01, ***p < 0,001).

Para confirmar el papel de los genes antes mencionados en la extensión de la vida útil, se alimentaron mutantes con pérdida de función de C. elegans para cada uno de estos genes con Weissella o E. coli OP50 y se evaluó su longevidad. Los gusanos mutantes alimentados con Weissella con mutaciones de pérdida de función en daf-16, aak-2 o jnk-1 no mostraron una extensión de la vida útil en comparación con el grupo de control de E. coli, lo que sugiere un papel esencial de estos genes en el aumento de la longevidad. de gusanos alimentados con Weissella (Tabla 1, Fig. S5). Inesperadamente, la esperanza de vida de los mutantes sod-3, jkk-1, skn-1, hif-1 y daf-2 aún aumentó cuando se alimentaron con Weissella. El hallazgo de que la pérdida de daf-2 no afecta la extensión de la vida útil sugiere que la vía IIS no está involucrada en la extensión de la vida útil dependiente de Weissella. En conjunto con los resultados de qRT-PCR, estos resultados anteriores sugieren que daf-16 puede ser la clave para promover la longevidad en los gusanos alimentados con Weissella.

Aunque W. koreensis y W. cibaria aislados de kimchi podrían ser candidatos a probióticos, hay poca información disponible sobre las especies de Weissella en general, incluido el efecto de extensión de la vida útil de Weissella en C. elegans. Anteriormente, se han estudiado biomarcadores del envejecimiento como la lipofuscina, el tamaño corporal y la actividad locomotora para estimar la prolongevidad en C. elegans. La alimentación de C. elegans con Weissella aumentó significativamente la MLS y se asoció negativamente con los biomarcadores del envejecimiento. La alimentación de C. elegans con Weissella redujo la acumulación de lipofuscina, el tamaño corporal, el tamaño de la cría y la tasa de bombeo faríngeo. Además, la actividad locomotora de C. elegans alimentados con Weissella disminuyó más lentamente que en los gusanos alimentados con E. coli OP50. El movimiento corporal se puede medir mediante la prueba locomotora y los resultados de la clase locomotora predicen la esperanza de vida restante de C. elegans después de los 8 días de edad21. La lipofuscina (denominada pigmento de la edad) se acumula en las células postmitóticas y, por tanto, es un marcador del envejecimiento en animales como C. elegans22. Las disminuciones en el tamaño corporal y la tasa de bombeo están relacionadas no solo con el envejecimiento sino también con la restricción dietética, que extiende la vida útil al reducir el tamaño de las crías23. La capacidad inherente de los nematodos para producir descendencia, la actividad de puesta de huevos de los nematodos adultos y la capacidad de los nematodos recién nacidos para sobrevivir y desarrollarse pueden afectar el tamaño de las crías. En este experimento, todos los C. elegans comieron E. coli OP50 durante la etapa larvaria temprana y, por lo tanto, se pudo excluir la influencia de Weissella en la capacidad inherente de los nematodos para producir descendencia. Durante el experimento, no hubo diferencias notables en la cantidad de huevos muertos y progenie que no se desarrolló entre los gusanos alimentados con E. coli OP50 y Weissella. Por lo tanto, Weissella podría afectar principalmente a la actividad de puesta de huevos de los nematodos adultos.

Además, la restricción dietética limita la producción de ATP en C. elegans y los niveles de ATP disminuyeron significativamente en C. elegans alimentados con Weissella en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50. Estos resultados sugieren que Weissella puede prolongar la vida útil de C. elegans mediante la restricción dietética. Según el ensayo de atracción, C. elegans inicialmente parece sentirse más atraído por E. coli OP50 que por Weissella; sin embargo, C. elegans no mostró preferencia entre E. coli OP50 y Weissella aproximadamente a los 60 minutos. Estos resultados podrían estar relacionados con el hecho de que C. elegans cambia rápidamente sus comportamientos y preferencias quimiosensoriales innatas24. Esto significa que la restricción dietética no estaba relacionada con una repulsión de C. elegans hacia Weissella.

Si bien los efectos biológicos de las ROS sobre la senescencia y la antisenescencia siguen siendo controvertidos25,26, generalmente se cree que las ROS (subproductos de la respiración) son perjudiciales para los procesos biológicos. Sin embargo, se ha informado que la producción de ROS induce enzimas que desintoxican los radicales de oxígeno para defenderse del daño de las ROS27. En este estudio, la producción de ROS disminuyó significativamente en los gusanos alimentados con W. koreensis, pero aumentó en los gusanos alimentados con W. cibaria en comparación con los controles. Esto puede haber ocurrido porque las especies de Weissella podrían producir diferentes tipos de ROS que son más o menos reactivos al diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCF-DA). Otros mecanismos también podrían haber afectado los resultados de ROS; por ejemplo, varios tipos de inhibidores podrían afectar los niveles de ROS en gusanos alimentados con W. koreensis o W. cibaria. Además, las diferencias en los niveles de ROS entre W. koreensis y W. cibaria podrían derivarse de las limitaciones de los métodos que utilizan DCF-DA28.

En C. elegans, la restricción dietética resultó en una producción de ROS de bajo nivel y una mayor esperanza de vida29. Aunque los factores implicados en la elevación de los niveles de ROS en C. elegans alimentados con W. cibaria siguen siendo desconocidos, se han informado varios efectos positivos con respecto a las ROS y la longevidad en C. elegans. Primero, ROS induce la expresión de superóxido dismutasa (SOD), que desintoxica ROS30,31. En segundo lugar, las ROS promueven la expresión de hif-1, que también regula la esperanza de vida. Aunque todavía no está claro cómo se activa HIF-1 en condiciones de bajo oxígeno y qué genes posteriores facilitan la extensión de la vida útil, un aumento en los niveles de ROS extiende la vida útil de C. elegans al estabilizar HIF-132. En tercer lugar, los niveles elevados de ROS inducen la fosforilación y la posterior activación de JNKs33, lo que también puede ocurrir en C. elegans. Todavía sigue siendo controvertido si la restricción dietética prolonga la vida útil al reducir la producción de ROS o al aumentar las defensas y la reparación de ROS34. Asimismo, los niveles de ROS en los gusanos alimentados con W. cibaria y W. koreensis aumentaron y disminuyeron, respectivamente, en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50. La producción de ROS en C. elegans alimentados con W. cibaria no fue consistente con los resultados de la lipofuscina, que es una mezcla compleja de macromoléculas oxidadas y entrecruzadas que incluyen proteínas, lípidos y carbohidratos. Los niveles de lipofuscina en gusanos alimentados con ambas especies de Weissella fueron significativamente más bajos que en los gusanos alimentados con E. coli OP50. Las actividades metabólicas y de desintoxicación cambian con la edad en C. elegans35. Además, los niveles de ROS se midieron utilizando gusanos de 4 días que se alimentaron de especies de Weissella durante 24 h, mientras que los niveles de lipofuscina se midieron utilizando gusanos de 14, 16 y 18 días, lo que puede haber causado la inconsistencia entre el nivel de ROS y la lipofuscina. acumulación en C. elegans alimentado con W. cibaria. Por lo tanto, a partir de nuestros datos no pudimos concluir cuáles fueron los efectos de la restricción dietética sobre los niveles de ROS.

Los resultados obtenidos utilizando W. koreensis o W. cibaria fueron ligeramente diferentes. En este estudio, W. koreensis no afectó la expresión del gen hif-1. Sin embargo, W. cibaria indujo la sobreexpresión de hif-1 y aún así aumentó la vida útil de los mutantes de hif-1. DAF-16/FOXO podría relocalizarse activamente en mutantes hif-1; Se ha demostrado que los mutantes hif-1 viven más que los gusanos de tipo salvaje porque derribar hif-1 desencadena la relocalización nuclear de DAF-16/FOXO36. La expresión de sod-3 aumentó en ambos grupos de Weissella, pero en menor medida en el grupo de W. koreensis. La vida útil de los mutantes sod-3 alimentados con W. koreensis y W. cibaria se extendió en comparación con la de los mutantes sod-3 alimentados con E. coli. Los resultados sugieren que SOD-3 no es un objetivo esencial de ninguna de las especies de Weissella para extender la vida útil de C. elegans. Sin embargo, la sobreexpresión de sod-3 en los gusanos alimentados con W. cibaria podría estar relacionada con el aumento de la producción de ROS en este grupo.

La prolongevidad relacionada con la restricción dietética se asocia con muchas vías, como la vía TOR, la vía AMPK, la vía IIS y las sirtuinas14. Entre estas vías, DAF-16, que funciona como factor de transcripción, desempeña un papel importante en la extensión de la vida37 al regular la longevidad, el metabolismo de las grasas, la respuesta al estrés, la desintoxicación de radicales libres y la resistencia a patógenos. Mientras tanto, la supresión de DAF-2, que está relacionada con la vía IIS, extiende la vida útil al regular negativamente DAF-1638. Sin embargo, en este estudio, la expresión de daf-16 aumentó en C. elegans alimentado con Weissella a pesar del aumento de la expresión de daf-2. Por lo tanto, la extensión de la vida aparentemente no estaba relacionada con la vía IIS. Los genes relacionados con el estrés sod-3 y hif-1 también pueden afectar la esperanza de vida de C. elegans30,31. Los genes jkk-1 y jnk-1 son miembros de la vía JNK39 y aak-2 activa la vía AMPK16. Utilizamos mutantes de pérdida de función de C. elegans para investigar las contribuciones relevantes de las vías asociadas a la longevidad a la esperanza de vida de C. elegans; Se utilizaron mutantes jnk-1 y aak-2 para investigar el papel de las vías JNK y AMPK, respectivamente. Descubrimos que varios genes relacionados con la edad aumentaron en los gusanos alimentados con Weissella y que tanto W. koreensis como W. cibaria no lograron extender la vida útil en los mutantes daf-16, aak-2 o jnk-1 de C. elegans, lo que sugiere que estos genes son esencial para la extensión de la vida útil en C. elegans alimentado con Weissella. JNK-1 y AAK-2 modulan la actividad de DAF-16 mediante fosforilación; específicamente, la familia JNK, un subgrupo de la superfamilia MAPK, es parte de la cascada de transducción de señales activada por la exposición al estrés ambiental y a citocinas40. En C. elegans, JNK-1 interactúa directamente con DAF-16 para mediar la translocación nuclear de DAF-16, lo que desencadena la regulación positiva de varios genes de respuesta al estrés y al daño39. De manera similar, recientemente se ha descubierto que AAK-2, que es una de las dos subunidades catalíticas α de AMPK, aumenta la longevidad de los gusanos41. AMPK es un mediador importante de la restricción dietética sobre la longevidad que actúa a través de DAF-16/FOXO16 y es independiente de la vía IIS porque DAF-16 es fosforilado directamente por AMPK16. El gen aak-2 codifica AMPK de baja energía y, por lo tanto, está relacionado con la restricción dietética. AMPK/aak-2 es necesario para mediar la extensión de la vida mediante la restricción dietética42. La vida útil del mutante aak-2 de C. elegans no se extendió y la expresión del gen aak-2 aumentó significativamente al alimentarse de Weissella. En C. elegans alimentado con Weissella, los niveles de ATP disminuyeron significativamente, lo que es consistente con la activación de la vía AMPK. Nuestros resultados demuestran que las especies de Weissella promueven la longevidad en C. elegans al aumentar la expresión de daf-16 a través de las vías JNK y AMPK.

El mecanismo de extensión de la vida útil de C. elegans alimentado con Weissella fue diferente del de los gusanos alimentados con B. infantis9 y L. rhamnosus10. Basándonos en qRT-PCR y datos de supervivencia de mutantes, predijimos las vías involucradas en la extensión de la vida útil de C. elegans alimentado con Weissella (Fig. 7). Brevemente, Weissella promovió la longevidad de C. elegans al inducir restricción dietética y respuesta al estrés y, en consecuencia, expresión posterior de daf-16 a través de las vías AMPK y JNK. No sabemos si Weissella tiene menos calorías o es menos nutritiva en comparación con E. coli OP50. Curiosamente, aunque el tamaño de la cría disminuyó, el período de crianza aumentó en C. elegans alimentado con Weissella. En este estudio, a C. elegans se le permitió alimentarse libremente de la fuente de alimento (E. coli OP50 o Weissella); por tanto, la restricción dietética no fue inducida artificialmente. La restricción dietética en C. elegans no se derivó de una repulsión hacia Weissella y no estuvo asociada con el ácido láctico producido por Weissella.

Mecanismo que se predice que estará involucrado en el efecto de extensión de la vida útil de Weissella.

JNK-1 y AAK-2 activan DAF-16 a través de las vías JNK y AMPK, respectivamente. El DAF-16 activado afectó a sod-3, hif-1 y otros genes relacionados con la longevidad. El receptor de insulina/IGF-1, DAF-2, no estaba relacionado con la extensión de la vida útil de C. elegans por parte de Weissella.

Metchnikoff planteó la hipótesis de que las bacterias del ácido láctico son importantes para la salud y la longevidad humanas basándose en la longevidad de los búlgaros que comen mucho yogur43. Es posible que existan mecanismos similares de prolongevidad en C. elegans. Además, se sabe que la restricción dietética prolonga la esperanza de vida y retarda el deterioro de la salud relacionado con la edad en varias especies diferentes, incluidos roedores, gusanos, levaduras y posiblemente primates44. No está claro si la restricción dietética afecta a otros animales de la misma manera, pero es posible que los mecanismos identificados en este estudio puedan aplicarse a otras especies, incluidos los humanos. Finalmente, las vías JNK y AMPK estimulan la autofagia bajo restricción dietética y, por lo tanto, se requieren más estudios sobre la posible relación entre la autofagia en la extensión de la vida útil de C. elegans por Weissella. Además, en el presente estudio, se investigó un subconjunto de genes que se sabe que prolongan la vida útil; por lo tanto, se necesitan más estudios para investigar todo el genoma de C. elegans para revelar otros posibles factores y/o vías que contribuyan a la extensión de la vida útil de C. elegans por parte de Weissella.

W. koreensis KACC 11853 y W. cibaria KACC 11845 se obtuvieron de la Colección de Cultivos Agrícolas de Corea (KACC) y se utilizaron como fuentes de alimento de prueba para nematodos. E. coli OP50 fue proporcionada por el Centro de Genética Caenorhabditis de la Universidad de Minnesota (CGC) y utilizada como fuente de alimento de control. E. coli OP50 se cultivó en caldo Luria-Bertani (LB) (Difco, Detroit, MI, EE. UU.) a 37 °C durante 18 a 24 h con agitación. Las cepas de Weissella se cultivaron a 30 °C para W. koreensis y 37 °C para W. cibaria en caldo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) (Difco) durante 24 h sin agitación. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos y se lavaron en tampón M9 estéril. Luego, las bacterias se ajustaron a una concentración final de 0,1 mg (peso húmedo) por microlitro en tampón M98.

El CGC proporcionó la cepa N2 de C. elegans Bristol (tipo salvaje) y las cepas mutantes. Se utilizó la cepa Bristol N2 para todas las mediciones excepto el ensayo de localización DAF-16 y el ensayo de longevidad con las cepas mutantes. Los mutantes utilizados para las mediciones de la vida útil fueron CF1038 daf-16 (mu86), RB754 aak-2 (ok524), EU1 skn-1 (zu67), GA186 sod-3 (tm760), VC8 jnk-1 (gk7), ZG596 hif- 1 (ia7), CB1370 daf-2 (e1370) y KU2 jkk-1 (km2). CF1407 daf-16 (mu86) I; Se usó muIs 71 [pKL99(daf-16Ap::GFP::daf-16A(bKO)) + pRF4(rol-6)] para el ensayo de localización de DAF-16. Los nematodos se mantuvieron y propagaron a 25 °C según técnicas estándar45. La suspensión bacteriana se extendió sobre medio de crecimiento de nematodos modificado (mNGM) libre de peptona en placas de 90 mm de diámetro para alimentar a los gusanos. Para excluir la posibilidad de efectos nematocidas de los nutrientes en el medio de crecimiento bacteriano, cada experimento se realizó en placas mNGM9. Los huevos se obtuvieron de gusanos adultos después de exponerlos a una solución de hipoclorito de sodio e hidróxido de sodio como se describió anteriormente46. La suspensión de huevos en tampón M9 se incubó durante la noche a 25 ° C para permitir que los huevos eclosionaran y la suspensión de gusanos en etapa L1 se centrifugó a 1200 x g durante 2 minutos. Después de retirar el sobrenadante, las larvas restantes se transfirieron a placas mNGM frescas sembradas con E. coli OP50 y se incubaron a 25 °C durante dos días para sincronizar la pubescencia. Todos los experimentos se realizaron con gusanos de tipo salvaje, adultos jóvenes (día 1 de edad adulta) de 3 días de edad (excepto las pruebas de supervivencia de mutantes).

Para el ensayo de longevidad, se produjeron placas mNGM/FUdR suplementando con 5-fluoro-2′-desoxiuridina (FUdR, Sigma Aldrich) (50 μM)47. Se esparcieron células de E. coli OP50, W. koreensis y W. cibaria en tampón M9 (20 mg de peso húmedo) sobre placas mNGM/FUdR (90 mm de diámetro). El ensayo de longevidad se inició en la etapa L4 de los nematodos y mutantes N2, después de lo cual los gusanos se transfirieron a placas con un alambre de platino. Para cada ensayo, se analizaron 30 gusanos en tres placas (10 gusanos por placa) para cada especie bacteriana. Las placas se incubaron a 25 °C y se contaron los gusanos vivos y muertos cada 24 h. Un gusano se consideraba muerto cuando no respondía a un toque suave con un recogedor de alambre de platino. Los gusanos que mostraban una muerte anormal, como progenie eclosionada dentro del cuerpo, explosión de la vulva o muerte como resultado de adherirse a la pared de la placa, se excluyeron del análisis de la vida útil. Durante el ensayo, los gusanos sometidos a prueba se transfirieron a placas mNGM frescas todos los días durante los primeros 3 días y una vez a la semana durante el resto del experimento para mantener una fuente de alimento suficiente. El ensayo de longevidad se realizó al menos tres veces de forma independiente. La esperanza de vida media se estimó utilizando la ecuación. (1)48:

donde j es la edad (día), dj es el número de gusanos que murieron en el intervalo de edad (xj, x j+1) y N es el número total de gusanos. El error estándar (SE) de la esperanza de vida media estimada (MLS) se calculó utilizando la ecuación. (2):

Los niveles totales de ROS se cuantificaron en gusanos enteros utilizando diacetato de 2,7-diclorodihidro-fluoresceína (H2-DCF-DA) (Sigma-Aldrich). Los niveles de ROS se determinaron según protocolos realizados previamente con ligeras modificaciones49. Brevemente, se alimentaron gusanos en cada césped bacteriano durante 24 h y se recogieron con tampón M9. Las bacterias se eliminaron lavando tres veces con tampón M9 y los gusanos se resuspendieron en tampón M9. Para evitar la sobreestimación de los niveles de ROS, se utilizaron gusanos enteros50. Se transfirió una alícuota de 50 µl de la suspensión a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos y se añadió una alícuota de 50 µl de la solución H2-DCF-DA 100 µM recién preparada, lo que dio como resultado una concentración final de 50 µM. Se utilizaron cuatro pocillos por muestra. Había pocillos de control que contenían nematodos de cada césped bacteriano sin H2-DCF-DA y que contenían H2-DCF-DA sin nematodos. Después de la adición de H2-DCF-DA, la señal fluorescente basal de cada pocillo se midió inmediatamente con un lector de microplacas de fluorescencia (SpectraMAX GEMINI EM, Molecular Devices) a longitudes de onda de excitación y emisión de 485 nm y 520 nm, respectivamente. Después de la lectura inicial, la placa se incubó a 25 °C durante 1 h y se midió la intensidad de la fluorescencia a la misma longitud de onda. El cambio en la fluorescencia se determinó restando el valor inicial del valor final para cada pocillo, incluidos los pocillos de control. Se utilizó un mililitro de la suspensión inicial de gusanos de cada muestra para la cuantificación de proteínas para normalizar la señal de fluorescencia. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes.

La autofluorescencia de la lipofuscina intestinal se midió como un índice de senescencia entre los días 10 y 18 de la edad adulta. Los gusanos seleccionados al azar de la placa cubierta con especies de E. coli OP50 o Weissella se lavaron tres veces con tampón M9. Luego se colocaron los gusanos sobre una almohadilla de agar al 5% recubierta con azida sódica 10 mM (Junsei Chemical, Tokio, Japón) en tampón M9 para inducir la anestesia. Las imágenes de autofluorescencia de lipofuscina se tomaron utilizando luz de excitación azul (405-488 nm), un canal DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) de un microscopio de barrido láser confocal (Olympus Ix81-FV1000, Japón)51. La fluorescencia se cuantificó los días 14, 16 y 18 utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.) para determinar los niveles de lipofuscina. Se realizaron tres experimentos independientes con más de 30 gusanos para cada especie bacteriana cada día.

La actividad locomotora de gusanos de diferentes edades se examinó utilizando un método de puntuación descrito en informes anteriores21,52. Los gusanos se clasificaron como clase “A” cuando mostraban movimiento espontáneo o locomoción vigorosa en respuesta a la estimulación; los gusanos de clase “B” no se movían a menos que se les pinchara o parecían tener movimientos descoordinados; los gusanos de clase “C” movían sólo la cabeza y/o la cola en respuesta a la presión; Los gusanos clase “D” estaban muertos. Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente y se puntuaron al menos 100 gusanos para cada especie bacteriana.

Se transfirieron gusanos adultos de tres días (etapa L4) a placas mNGM (60 mm de diámetro) cubiertas con 5 mg (peso húmedo) de células OP50 de Weissella o E. coli en tampón M9. Las placas se incubaron a 25 °C y el tamaño corporal de los gusanos vivos se midió cada 24 h hasta los 7 días de edad. Se ensayaron cinco gusanos por especie bacteriana utilizando cinco placas (un gusano por placa). Se tomaron imágenes de gusanos con un microscopio estereoscópico (Olympus SZ61) y una ToupCam (UCMOS05100KPA). Las imágenes se analizaron utilizando el software ImageJ. En este sistema, el área de proyección de un gusano se estimaba automáticamente y se utilizaba como índice del tamaño corporal7. Se realizaron tres experimentos independientes con 20 gusanos para cada especie bacteriana.

Los gusanos en etapa L4 se transfirieron a placas mNGM recubiertas con Weissella o E. coli OP50 y se incubaron a 25 °C. Los animales parentales se transfirieron diariamente a placas mNGM frescas (60 mm de diámetro) hasta el final del período reproductivo. La descendencia de cada animal se contó en la etapa L2 o L3. Se analizaron diez gusanos por especie bacteriana utilizando cinco placas (dos gusanos por placa) y la prueba se realizó tres veces9.

Los ensayos de bombeo se realizaron en placas mNGM con césped bacteriano a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, los gusanos en etapa L4 (3 días de edad) se transfirieron a placas mNGM sembradas con bacterias y se contó el número de contracciones en el bulbo terminal de la faringe durante 1 minuto utilizando un microscopio invertido Olympus CKX41 (× 400). Las lombrices se incubaron a 25 °C y la velocidad de bombeo de las lombrices en cada césped bacteriano se midió cada 24 h8. Se realizaron tres experimentos independientes con 20 gusanos para cada especie bacteriana cada día.

Se recogieron gusanos adultos de cuatro días de edad alimentados en cada césped bacteriano durante 24 h y se lavaron tres veces en tampón M9. Los gránulos de lombriz se trataron con tres ciclos de congelación/descongelación y se hirvieron durante 15 minutos para liberar ATP y destruir la actividad ATPasa. Después de eso, los gusanos se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 ° C y se cuantificaron los niveles de ATP con el kit ATPlite de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PerkinElmer, EE. UU.). La luminiscencia se midió con un lector de microplacas de fluorescencia (Molecular Devices, SpectraMAX GEMINI EM). La concentración de proteína soluble de la misma preparación se midió utilizando el ensayo de Bradford y el valor del contenido de ATP se normalizó frente al nivel de proteína53. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes.

Para examinar la actividad quimiotáctica de los gusanos hacia Weissella, etanol al 95% (Samchun Chemical, Corea), ácido láctico (Samchun Chemical) y tampón M9, diseñamos un ensayo de quimiotaxis con una ligera modificación de los métodos de Bargmann54 y Beale55. Se colocó alimento bacteriano u otro material en el centro de las placas mNGM de 90 mm de diámetro (Fig. S3) y se colocaron más de 1000 gusanos a 10 mm de los lados de las placas. Después de 30 min y 60 min de incubación a 25 °C, se contó el número de gusanos en el círculo de 30 mm de diámetro en el centro de cada placa, incluido cada césped bacteriano. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes.

Los gusanos alimentados con E. coli OP50 o Weissella durante 24 h se recogieron en tampón M9 y se aisló el ARN total de los gusanos enteros como se informó anteriormente56. El ARN total se convirtió en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific), seguido de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) utilizando SYBR green (KAPA Biosystems, EE. UU.) y StepOnePlus en tiempo real. Sistema PCR (Applied Biosystems). Los cebadores se diseñaron utilizando el software Primer 357. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S3. Las reacciones se iniciaron a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 20 s, 56 °C durante 20 s y 72 °C durante 30 s, seguido del análisis de la curva de fusión. Los niveles de expresión relativos se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCT58. El gen de control act-2 se utilizó para normalizar los datos de expresión génica59. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes.

La cepa transgénica CF1407 daf-16(mu86)I; Se usó muIs 71 [pKL99(daf-16Ap::GFP::daf-16A(bKO)) + pRF4(rol-6)] para detectar la localización intracelular de la proteína DAF-16 marcada con GFP. Gusanos de 4 días de edad seleccionados al azar que fueron alimentados en placas cubiertas con especies de E. coli OP50 o Weissella durante 24 h se lavaron tres veces con tampón M9. Luego se colocaron los gusanos sobre almohadillas de agar al 5% recubiertas con azida sódica 10 mM (Junsei Chemical, Tokio, Japón) en tampón M9 para inducir la anestesia. Las imágenes de GFP se tomaron utilizando luz de excitación verde (460-495 nm), un canal GFP (proteína de fluorescencia verde) de un microscopio de barrido láser confocal (Olympus Ix81-FV1000, Japón). La localización de DAF-16 GFP desde el citoplasma hasta los núcleos celulares se examinó analizando el grado de fluorescencia nuclear de GFP. Se pueden distinguir fácilmente tres estados diferentes (fluorescencia nuclear nula, débil o fuerte de GFP), que están relacionados con una ubicación citoplásmica, intermedia o nuclear de DAF-16-GFP60. El grado de translocación nuclear de DAF-16 se evaluó contando el número de gusanos que mostraban fluorescencia nuclear de GFP débil o fuerte. Se realizaron tres experimentos independientes con más de 90 gusanos para cada especie bacteriana.

La tasa de supervivencia de los nematodos se calculó mediante el método de Kaplan-Meier y la importancia de las diferencias de supervivencia se probó mediante la prueba de Log-rank8. Las diferencias en los niveles de lipofuscina se evaluaron mediante la prueba U de Mann-Whitney9. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba post hoc de Tukey para comparar el efecto de Weissella en las tasas de bombeo faríngeo y se utilizó ANOVA con la prueba de Duncan para comparar la quimiotaxis hacia diferentes fuentes de alimentos. Los resultados se consideraron significativos si p < 0,05. En otros experimentos, las medias de los valores de los grupos OP50 y Weissella de E. coli se determinaron mediante la prueba t de Student. Los valores de p ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativos y las barras de error representan la desviación estándar.

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Con el apoyo de la beca de la Universidad de Corea (K1508391).

Departamento de Ciencias de la Salud Pública (programa Brain Korea 21 PLUS), Escuela de Graduados, Universidad de Corea, Seúl, 136-701, República de Corea

Jiyun Lee, Gayeung Kwon y Young-Hee Lim

Escuela de Biosistemas y Ciencias Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Corea, Seúl, República de Corea

Young Hee Lim

Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Guro de la Universidad de Corea, Seúl, República de Corea

Young Hee Lim

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YHL y JL diseñaron la investigación y JL, GK y YHL realizaron los experimentos. YHL y JL escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Lee, J., Kwon, G. y Lim, YH. Aclaración del mecanismo de extensión de la vida útil dependiente de Weissella en Caenorhabditis elegans. Representante científico 5, 17128 (2015). https://doi.org/10.1038/srep17128

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Recibido: 14 de julio de 2015

Aceptado: 26 de octubre de 2015

Publicado: 25 de noviembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep17128

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