La remofuscina induce la desintoxicación xenobiótica a través de un lisosoma

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 7161 (2022) Citar este artículo

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La lipofuscina es un biomarcador representativo del envejecimiento que se genera de forma natural con el tiempo. La remofuscina (soraprazan) mejora las enfermedades oculares relacionadas con la edad al eliminar la lipofuscina de las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR). En este estudio, se investigó el efecto de la remofuscina sobre la longevidad en Caenorhabditis elegans y el mecanismo subyacente. Los resultados mostraron que la remofuscina extendió significativamente (p <0,05) la vida útil de C. elegans (N2) en comparación con el control negativo. Los biomarcadores del envejecimiento mejoraron en los gusanos tratados con remofuscina. Los niveles de expresión de genes relacionados con los lisosomas (lipl-1 y lbp-8), un receptor de hormonas nucleares (nhr-234), la betaoxidación de ácidos grasos (ech-9) y la desintoxicación de xenobióticos (cyp-34A1, cyp-35A1 , cyp-35A2, cyp-35A3, cyp-35A4, cyp-35A5, cyp-35C1, gst-28 y gst-5) aumentaron en los gusanos tratados con remofuscina. Además, la remofuscina no logró prolongar la vida de C. elegans con mutaciones de pérdida de función (lipl-1, lbp-8, nhr-234, nhr-49, nhr-8, cyp-35A1, cyp-35A2, cyp- 35A3, cyp-35A5 y gst-5), lo que sugiere que estos genes están asociados con la extensión de la vida útil en C. elegans tratado con remofuscina. En conclusión, la remofuscina activa la vía del lisosoma al núcleo en C. elegans, lo que aumenta los niveles de expresión de los genes de desintoxicación xenobióticos y prolonga su vida útil.

El envejecimiento induce cambios metabólicos como la acumulación de lipofuscina, que sirve como biomarcador del envejecimiento1. La acumulación de lipofuscina, que está compuesta de proteínas, lípidos y metales altamente oxidados, se ve potenciada por las ROS producidas por mitocondrias y lisosomas dañados y causa enfermedades oculares y enfermedades neurodegenerativas2. Remofuscina (soraprazan, (7R,8R,9R)-7-(2-metoxietoxi)-2,3-dimetil-9-fenil-7,8,9,10-tetrahidroimidazo[1,2-h][1,7 ]naftiridin-8-ol) se desarrolló para tratar la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la enfermedad de Stargardt mediante la eliminación de la lipofuscina de las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR). La DMAE y la enfermedad de Stargardt son inducidas por el envejecimiento o por un defecto innato en el miembro 4 de la subfamilia A del casete de unión de ATP (ABCA4), y la lipofuscina se acumula en las células del EPR, lo que puede provocar ceguera3,4. La lipofuscina producida no se degrada ni se excreta fácilmente fuera de la célula envejecida5, pero se demostró que la remofuscina elimina cantidades significativas de lipofuscina de las células del EPR en monos cynomolgus6.

El modelo de C. elegans es adecuado para estudiar diversas funciones biológicas, incluidas las enfermedades humanas y el envejecimiento7. C. elegans crece en placas de agar y se alimenta de microbios, por lo que es fácil y económico de manipular en el laboratorio. El cuerpo de C. elegans es transparente y visible al microscopio. C. elegans, que se propaga principalmente mediante autofecundación, tiene una vida particularmente corta y su genoma completo ha sido secuenciado. Además, aproximadamente la mitad de los genes de C. elegans tienen ortólogos humanos y aproximadamente el 70% de los genes relacionados con enfermedades humanas tienen homólogos en C. elegans8. A medida que C. elegans envejece, la lipofuscina autofluorescente se acumula en el intestino. Por lo tanto, C. elegans es un buen modelo para estudiar la extensión de la vida útil al disminuir la acumulación de lipofuscina porque la acumulación de lipofuscina acorta la vida útil de C. elegans.

La extensión de la esperanza de vida se deriva de muchos factores, como la restricción de la dieta (RD) y el fortalecimiento de la inmunidad, en una amplia gama de taxones que van desde levaduras hasta primates9,10. Muchas de las vías que regulan la esperanza de vida están relacionadas con el metabolismo de los lípidos, y los lípidos actúan como moléculas de señalización en las vías de señalización de la longevidad. El metabolismo de los lípidos también se altera con el tiempo, por lo que el envejecimiento y la longevidad están regulados por la señalización de los lípidos11. Los genes de beta-oxidación están regulados positivamente en un estado similar a una restricción dietética (DR), lo que reduce en consecuencia la cantidad de grasa almacenada, lo que conduce a niveles más bajos de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS están relacionadas con el envejecimiento y el daño oxidativo12. La RD es una de las intervenciones ambientales más influyentes que extiende la esperanza de vida de una variedad de especies13. El aumento de la betaoxidación de ácidos grasos induce la expresión de genes de desintoxicación xenobióticos para eliminar las endotoxinas lipófilas producidas durante el catabolismo de los lípidos, y el cambio metabólico resultante aumenta la longevidad de C. elegans14. En el estado DR, los lisosomas desempeñan un papel importante en los primeros pasos catabólicos de la degradación de los lípidos15. C. elegans tiene ocho lipasas lisosomales, LIPL-1 a LIPL-816; LIPL-4 se ha estudiado ampliamente porque desempeña funciones importantes en la autofagia, el metabolismo de las grasas y la actividad lisosomal, que están relacionadas con la longevidad en C. elegans17,18,19. Entre los genes de la lipasa lisosomal, lipl-1 es el más regulado en ayunas y su secuencia es similar a la de la lipasa ácida lisosomal humana (puntuaciones BLAST 9e-78)20. Sin embargo, no se ha estudiado el mecanismo por el cual LIPL-1 extiende la vida útil de C. elegans.

En este estudio, planteamos la hipótesis de que la remofuscina extendería la vida útil posiblemente al prevenir la acumulación de lipofuscina porque la lipofuscina se acumula con el tiempo y la remofuscina previene la acumulación de lipofuscina. Por lo tanto, en este documento investigamos el efecto de la remofuscina en la extensión de la vida útil en C. elegans y dilucidamos el mecanismo subyacente.

La remofuscina aumentó significativamente (p <0,05) la esperanza de vida media (MLS) de C. elegans (N2) de tipo salvaje de una manera dependiente de la dosis en comparación con la de NC (control negativo, remofuscina 0 μM) (Tabla 1, Datos complementarios ). En comparación con las de las NC, las MLS de C. elegans (N2) tratadas con remofuscina 50 µM, 100 µM y 200 µM aumentaron en un 9,9%, 14,6% y 20,4%, respectivamente. Los porcentajes de supervivencia de los gusanos tratados con remofuscina fueron mayores que los de los gusanos no tratados después de 5 días (Figura complementaria S1).

Para investigar el efecto de la remofuscina en la extensión de la vida útil en C. elegans, se midió la tasa de bombeo faríngeo, un biomarcador relacionado con la edad. Una tasa de bombeo faríngeo reducida indica una disminución en la alimentación, lo que puede inducir un estado similar al DR21. La DR reduce el tamaño corporal de Caenorhabditis elegans, lo que podría estar asociado con una mayor esperanza de vida22. Las tasas de bombeo faríngeo de los grupos tratados con remofuscina disminuyeron significativamente (p <0,05) en comparación con las del grupo NC (Fig. 1A). Independientemente de si C. elegans fue tratado con o sin remofuscina, la tasa de bombeo faríngeo disminuyó hasta el día 6; sin embargo, las tasas de bombeo de los gusanos tratados con remofuscina 100 μM y 200 μM los días 8 y 10 fueron casi similares o incluso superiores a las del día 6. En contraste, la tasa de bombeo faríngeo del grupo NC disminuyó continuamente durante 10 días. La longitud del cuerpo de los gusanos vivos se midió cada 24 h hasta los 6 días de edad. Si bien la longitud del cuerpo aumentó con la edad en todos los grupos, los de los grupos tratados con remofuscina fueron significativamente más cortos que los del grupo NC (Fig. 1B). Los resultados sugieren que la disminución de la tasa de bombeo faríngeo en C. elegans tratada con remofuscina podría inducir un estado similar al DR y, en consecuencia, reducir el tamaño corporal de C. elegans.

Efecto de la remofuscina sobre la tasa de bombeo faríngeo, el tamaño corporal y la generación de ROS en C. elegans (N2). C. elegans de tres días de edad (día 1 de la etapa adulta) alimentados con un césped de E. coli OP50 se transfirieron a placas mNGM frescas que contenían E. coli OP50 y varias concentraciones de remofuscina. La tasa de bombeo en el bulbo terminal se midió durante 1 min cada 48 h desde el día 4 al día 10, y se determinó la tasa media de 15 gusanos de cada grupo (A). Se midieron las longitudes corporales de 10 gusanos de cada grupo (B). Niveles de ROS en C. elegans tratado con remofuscina (N2) (C). Los niveles relativos de ROS se midieron después de 14 días de tratamiento con remofuscina. La señal de fluorescencia en cada grupo (más de 80 gusanos para cada medición) se normalizó con respecto a la concentración de proteína en el grupo. Todos los experimentos se realizaron tres veces de forma independiente. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, prueba t de Student, en comparación con la NC (remofuscina 0 μM).

Para investigar el efecto inhibidor de la remofuscina sobre la generación de ROS en C. elegans, se midieron los niveles totales de ROS en gusanos tratados con remofuscina. Los niveles de ROS en C. elegans cultivados en placas que contenían remofuscina 100 μM y 200 μM durante 14 días disminuyeron significativamente (p <0,05) en comparación con los del grupo NC (Fig. 1C). Los resultados sugieren que las reducciones de ROS inducidas por remofuscina podrían afectar la extensión de la vida útil en C. elegans.

La acumulación de lipofuscina sirve como biomarcador del envejecimiento, y la remofuscina disminuyó significativamente los niveles de lipofuscina en C. elegans tratados con remofuscina 100 μM y 200 μM el día 14 (Fig. 2). Estos resultados sugieren que la remofuscina afecta la esperanza de vida de C. elegans.

Acumulación de lipofuscina en C. elegans tratada con remofuscina (N2). (A) Imágenes de fluorescencia de lipofuscina en gusanos tratados con diversas concentraciones de remofuscina el día 14 (barra de escala = 100 m). (B) La fluorescencia de la lipofuscina en los gusanos se cuantificó utilizando el software ImageJ. Para las mediciones se utilizaron diez gusanos de cada grupo. Todos los experimentos se realizaron tres veces de forma independiente. *p < 0,05, ***p < 0,001, prueba t de Student, en comparación con la NC (remofuscina 0 μM).

Para investigar el mecanismo por el cual la remofuscina promueve la longevidad, se realizó un análisis de microarrays de gusanos de tipo salvaje (N2) tratados con remofuscina 0 µM (NC) y 200 µM durante 14 días. Se identificaron un total de 31.383 genes, entre los cuales 340 y 103 genes estaban significativamente (p < 0,05) regulados positivamente (≥ dos veces) y disminuidos (≤ 0,5 veces), respectivamente, entre los gusanos tratados con NC y remofuscina 200 µM (Fig. 3A). Según los términos representados en la base de datos GO, los genes expresados diferencialmente (DEG) se dividieron en tres categorías: proceso biológico (BP), componente celular (CC) y función molecular (MF). El análisis GO mostró 10 categorías funcionales principales en el grupo BP, 8 categorías en el grupo CC y 7 categorías en el grupo MF según el criterio para identificar genes expresados diferencialmente mediante análisis de microarrays (cambio de veces ≥ 2,0 y p <0,05) (Fig. .3B). Entre estos genes, los relacionados con la respuesta a estímulos xenobióticos se expresaron altamente en los gusanos tratados con remofuscina 200 μM en comparación con los gusanos NC. Se sabe que la desintoxicación xenobiótica afecta la longevidad en C. elegans y, según la importancia total (Fig. 3C), nos centramos en los genes relacionados con las respuestas al estímulo xenobiótico. Los genes relacionados con el metabolismo xenobiótico (GO: 0006805) (cyp-13A2, cyp-34A1, cyp-35A1, cyp-35A2, cyp-35A3, cyp-35A4, cyp-35A5, cyp-35C1, gst-28, gst- 5, ugt-65, pgp-14 y folt-2) aumentaron significativamente (p <0,05) (> dos veces) en comparación con los del grupo NC (remofuscina 0 µM), según lo determinado mediante análisis de microarrays (Tabla complementaria S1).

Expresión genética diferencial entre el control negativo y los grupos tratados con remofuscina 200 µM según lo determinado mediante análisis de micromatrices de ARN. Se utilizó el software de análisis DEG (ExDEGA v.1.6.8, Ebiogen, KOR) para mostrar los datos de expresión génica como un gráfico de volcán (A). Los genes en los cuadros están relacionados con la desintoxicación xenobiótica que se muestra en la Tabla complementaria S1 (cambio en veces ≥ 2,0 y p <0,05). Se utilizó la herramienta de anotación funcional DAVID para analizar los términos de ontología genética (B), y los procesos biológicos asociados con los DEG revelados por el análisis de microarrays se muestran como un gráfico circular (C).

Según los resultados de los microarrays, los niveles de expresión de genes relacionados con las lipasas lisosomales (lipl-1), los transportadores de ácidos grasos de cadena larga (lbp-8), la betaoxidación de ácidos grasos (ech-9) y la desintoxicación xenobiótica (cyp- 35A subfamilia, gst-5 y gst-28) en C. elegans (N2) tratados con remofuscina 0 y 200 µM durante 1 día y 5 días se midieron mediante qPCR. Los niveles de expresión de genes relacionados con el metabolismo xenobiótico, especialmente los genes de la subfamilia cyp35A, aumentaron significativamente en los gusanos tratados con remofuscina en comparación con los gusanos NC (Fig. 4). En su mayoría, los niveles de expresión genética fueron más altos el día 5 que el día 1. Además, los niveles de expresión de lipl-1, lbp-8 y ech-9 aumentaron significativamente en los gusanos tratados con remofuscina. Aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas, los niveles de varios genes del receptor de hormonas nucleares (NHR), factores de transcripción de los genes de la familia del citocromo p450, aumentaron más del doble, según lo determinado mediante análisis de microarrays (Tabla complementaria S2). Entre ellos, los niveles de solo nhr-210 y nhr-234 aumentaron significativamente en los gusanos tratados con remofuscina en comparación con los gusanos NC, según lo determinado mediante análisis de qPCR (Fig. 4).

Niveles de expresión de genes relacionados con el metabolismo xenobiótico, lisosomas y NHR en C. elegans tratado con remofuscina. Los gusanos se cultivaron en placas de NGM que contenían remofuscina 0 µM y 200 µM durante 1 y 5 días, y los niveles de expresión génica se midieron mediante qPCR. Los experimentos se realizaron de forma independiente al menos tres veces. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, prueba t de Student, en comparación con la NC (remofuscina 0 μM) en cada día.

Para dilucidar el mecanismo por el cual la remofuscina extiende la vida útil de C. elegans, se utilizaron mutantes de pérdida de función para genes relacionados con la desintoxicación xenobiótica en ensayos de longevidad. Los mutantes con pérdida de función disponibles en CGC y NBRP se seleccionaron en función de los resultados de qPCR. Además, aunque los niveles de expresión de los genes del factor de transcripción (nhr-49, nhr-8, ahr-1 y pha-4) relacionados con el metabolismo de los lípidos y las respuestas al estímulo xenobiótico en C. elegans no estaban regulados positivamente en los gusanos tratados con remofuscina en comparación con el NC (Figura complementaria S2), se utilizaron mutantes con pérdida de función para evaluar la extensión de la vida útil según informes previos de que regulan la expresión de genes relacionados con el metabolismo de lípidos y xenobióticos 14,23,24,25,26. El tratamiento con remofuscina no logró extender la vida útil de los gusanos que exhiben mutaciones de pérdida de función de genes relacionados con el metabolismo de los lípidos (lipl-1 y lbp-8) y la desintoxicación de xenobióticos (cyp-35A1, cyp-35A2, cyp-35A3, cyp-35A5 y gst-5) (Tabla 2, Datos complementarios, Figura complementaria S3). Curiosamente, la remofuscina no logró extender la vida útil de C. elegans que alberga mutantes del factor de transcripción (nhr-49, nhr-8 y nhr-234), pero no la de los gusanos con el mutante nhr-210. Aunque la eliminación de ahr-1 y pha-4 extendió la vida útil de los gusanos tratados con remofuscina 100 μM y 200 μM, respectivamente, sus MLS generales disminuyeron con el tratamiento con remofuscina en comparación con el tipo salvaje.

NHR-234 coopera con NHR-49 para inducir la transcripción de genes diana relacionados con el metabolismo de los lípidos. Los nematodos tratados con remofuscina aumentaron la expresión de nhr-234 en comparación con la del grupo de control, y el mutante nhr-234 no logró extender la vida útil de los gusanos. Para investigar el efecto de NHR-234 en la expresión de genes relacionados con el metabolismo de los lípidos y la desintoxicación xenobiótica propuestos aguas abajo de NHR-234 en C. elegans tratados con remofuscina, los niveles de expresión de ech-9, cyp-35A1, cyp- 35A2, cyp-35A3, cyp-35-A4 y cyp-35A5 en los mutantes de deleción nhr-234 se analizaron mediante qPCR. Los niveles de expresión de ech-9, cyp-35A2, cyp-35A3 y cyp-35-A4, pero no de cyp-35A1 y cyp-35A5, no aumentaron en los mutantes de deleción nhr-234 tratados con remofuscina (200 µM). en comparación con los gusanos de tipo salvaje (N2), lo que indica que NHR-234 podría regular su expresión (Fig. 5).

Niveles de expresión de los miembros de la subfamilia ech-9 y cyp-35A en C. elegans de tipo salvaje (N2) (WT) y mutante nhr-234. Los gusanos se cultivaron en placas de NGM que contenían remofuscina 0 µM y 200 µM durante 5 días, y los niveles de expresión génica se midieron mediante qPCR. Los experimentos se realizaron de forma independiente al menos tres veces. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, prueba t de Student, en comparación con la NC de tipo salvaje (N2) (remofuscina 0 μM) y ###p < 0,001, prueba t de Student , en comparación con los gusanos de tipo salvaje (N2) tratados con remofuscina 200 µM.

La remofuscina redujo la acumulación de lipofuscina en las células del EPR de monos cynomolgus6. En este estudio, encontramos que la remofuscina redujo la acumulación de lipofuscina en C. elegans, lo que estaba potencialmente relacionado con la extensión significativa de MLS en C. elegans tratada con remofuscina. En C. elegans, a pesar de un suministro abundante de alimentos, una tasa de bombeo faríngea reducida se asocia con una menor ingesta de alimentos, lo que podría inducir un estado similar al DR en el que el metabolismo energético cambia de la glucosa a la oxidación de lípidos, lo que resulta en una regulación positiva de la beta. -genes de oxidación27. La generación de ROS a través de la beta-oxidación se reduce en el catabolismo de los lípidos en comparación con el catabolismo de la glucosa14. En este caso, la remofuscina redujo la tasa de bombeo faríngeo y, en consecuencia, redujo la producción de ROS, lo que puede haber contribuido a la extensión de la vida útil de C. elegans tratada con remofuscina. En el estado de RD, la tasa de catabolismo de los lípidos aumenta para suministrar energía, y el catabolismo de los lípidos genera metabolitos de los lípidos que pueden mediar la lipotoxicidad14. Los análisis de microarrays y qPCR de gusanos tratados con remofuscina en un estado similar a DR revelaron que los genes relacionados con los lisosomas (lipl-1 y lbp-8), la betaoxidación (ech-9) y la desintoxicación xenobiótica (cyp-34A1, cyp -35A1, cyp-35A2, cyp-35A3, cyp-35A4, cyp-35A5, cyp-35C1, gst-28 y gst-5) estaban regulados positivamente, lo que puede haber prevenido el daño causado por los metabolitos lipídicos.

C. elegans tiene 8 lipasas lisosomales, LIPL-1 a LIPL-8, entre las cuales LIPL-4 desempeña un papel en la extensión de la vida útil de C. elegans24. La sobreexpresión de LIPL-4 induce la expresión de la proteína chaperona lipídica LBP-8, y la beta-oxidación mitocondrial se activa a través de NHR-49 y NHR-80 para promover el catabolismo de los lípidos. Las ROS en las mitocondrias (mtROS) activan el factor de transcripción JUN-1, y las vías de señalización LIPL-4 y LBP-8 inducen objetivos antioxidantes y tolerancia al estrés oxidativo, extendiendo así la vida útil de C. elegans26. Sin embargo, la remofuscina no aumentó el nivel de expresión de jun-1 en C. elegans. Los genes de C. elegans implicados directa o indirectamente en el catabolismo de los lípidos, especialmente LIPL-1, responden al estado de DR y controlan el metabolismo de los lípidos20. En este estudio, los niveles de expresión de genes relacionados con una lipasa lisosomal (lipl-1), una proteína fijadora de lípidos (lbp-8) y la beta-oxidación (ech-9) aumentaron en los gusanos tratados con remofuscina. Además de jun-1, los factores de transcripción nhr-49 y nhr-27 desempeñan un papel en la longevidad de C. elegans al reducir la cadena de transporte de electrones mitocondrial28. A diferencia de los mamíferos, que tienen sólo 48 genes NHR, C. elegans tiene 284 genes NHR que desempeñan funciones en diversos procesos, incluido el metabolismo de lípidos y xenobióticos. En particular, se sabe que NHR-49, un homólogo del factor nuclear 4 de hepatocitos de mamíferos (HNF4) que funciona de manera similar a los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR), regula transcripcionalmente muchos genes relacionados con la beta-oxidación, incluida la acil-CoA sintetasa, enoil-CoA hidratasa y carnitina palmitoil transferasa29,30. Sin embargo, el efecto de NHR-49 sobre ech-9 (gen de la enoil-CoA hidratasa) sigue siendo discutible14,29. En este estudio, aunque el nivel de expresión del gen nhr-49 no aumentó, el de ech-9 sí aumentó en C. elegans tratado con remofuscina. Además, la eliminación de nhr-49 no logró extender la vida útil de los gusanos tratados con remofuscina, lo que indica el posible papel de NHR-49 en la longevidad de C. elegans tratados con remofuscina. Curiosamente, descubrimos que la expresión genética del receptor nuclear NHR-234, que se sabe que coopera con NHR-49, estaba significativamente aumentada en C. elegans tratada con remofuscina y que el mutante nhr-234 no logró extender la vida útil de los gusanos. . La información sobre la función de nhr-234 en C. elegans es limitada. A diferencia de los gusanos de tipo salvaje (N2), aquellos con mutantes de deleción nhr-234 (VC1806) no exhibieron mayores niveles de expresión de los genes relacionados con el metabolismo de los lípidos (ech-9) y las respuestas a estímulos xenobióticos (cyp-35A2, cyp-35A3). , y cyp-35A4), que pueden estar regulados por NHR-234. Por tanto, NHR-234 con o sin NHR-49 desempeña un papel en la longevidad de los gusanos tratados con remofuscina al regular la expresión de ech-9 y, posteriormente, alterar la expresión de genes relacionados con la desintoxicación xenobiótica.

La lipofuscina endógena, el producto que contiene lípidos resultante de la oxidación de ácidos grasos insaturados compuestos de residuos lisosomales que contienen lípidos digeridos, se acumula con el tiempo y puede ser un xenobiótico. Además, la remofuscina puede actuar como un agente xenobiótico exógeno. La dependencia de la oxidación de ácidos grasos como fuente de energía conduce a la formación de endotoxinas lipófilas y, a su vez, activa genes de desintoxicación xenobióticos31,32. La desintoxicación xenobiótica se produce en tres fases: fase I (las enzimas citocromo p450 (CYP) modifican químicamente las endotoxinas), fase II (UDP-glucuronosil transferasas y glutatión S-transferasas (GST) las hacen más solubles) y, finalmente, fase III (endotoxinas modificadas). son emitidos al espacio extracelular por transportadores de casetes de unión a ATP)32,33. En este estudio, los niveles de expresión de los genes cyp (enzimas citocromo p450) y gst (glutatión S-transferasas) aumentaron en C. elegans tratado con remofuscina. GST funciona como antioxidante en reacciones de desintoxicación e inhibe la generación de ROS. Además, la GST detiene o retarda la formación de lipofuscina y escinde la lipofuscina existente34. Los factores de transcripción NHR-8, AHR-1 y PHA-4 regulan la expresión de genes relacionados con el metabolismo xenobiótico. NHR-8 es necesario para la resistencia a los xenobióticos y puede regular la expresión de los genes del citocromo P450 en C. elegans23, la unión de AHR-1 al elemento de respuesta xenobiótico (XRE), que está relacionado con los miembros de la subfamilia CYP-35A que poseen elementos similares a XRE en el regiones promotoras, regula la señalización de lípidos35 y PHA-4 induce la expresión de genes de desintoxicación xenobióticos14. En este estudio, encontramos que la eliminación de nhr-8 no logró extender la vida útil de los gusanos tratados con remofuscina, lo que significa que los genes relacionados con la desintoxicación xenobiótica activada por la remofuscina conferían longevidad a C. elegans.

Con base en los resultados obtenidos en este estudio, predijimos una vía asociada con la extensión de la vida útil en C. elegans tratado con remofuscina (Fig. 6). La remofuscina aumenta la expresión de la lipasa lisosomal e induce el catabolismo lipídico (beta-oxidación), activando posteriormente la respuesta de desintoxicación xenobiótica y extendiendo la vida útil de C. elegans. Además, los gusanos tratados con remofuscina entran en un estado similar al DR al disminuir su tasa de bombeo faríngeo, lo que es seguido por una reducción en los niveles de ROS a través de la betaoxidación de ácidos grasos, lo que contribuye a prolongar su vida útil. La señalización lisosomal de LIPL-4 a LBP-8 seguida de NHR-49 y NHR-80 promueve la longevidad de C. elegans36; sin embargo, la señal aquí se observó desde LIPL-1 a LBP-8, seguido de NHR-234 y/o NHR-49.

Mecanismo previsto por el cual la remofuscina extiende la vida útil de C. elegans. Una lipasa lisosomal, LIPL-1, activa el catabolismo lipídico, similar al de un estado similar a una restricción dietética (DR), disminuyendo así los niveles de ROS y posteriormente activando el proceso de desintoxicación xenobiótica. En última instancia, esta secuencia extiende la vida útil de C. elegans tratada con remofuscina. La línea discontinua muestra la ruta prevista según la ruta informada anteriormente14.

La remofuscina también se conoce como un inhibidor potente y reversible de la bomba de protones \(\small {H}^{+}/{K}^{+}\) ATPasa en monos cynomolgus6. Aunque la bomba de protones inhibida por la remofuscina no está presente en el EPR en los ojos humanos, se sabe que los inhibidores de la bomba de protones aumentan el pH lisosomal, activando así el factor de transcripción EB (TFEB), un regulador transcripcional maestro de la biogénesis lisosomal, y inducir exocitosis lisosomal y autofagia37. La remofuscina se une a la lipofuscina38 y es un generador de superóxido cuando se ilumina con luz39. El superóxido podría ayudar a degradar la lipofuscina polimérica en unidades más pequeñas que luego se transportan fuera de los lisosomas mediante exocitosis. TFEB es un ortólogo de HIH-30 en C. elegans, y se sabe que HIH-30 funciona como factor de transcripción de lipl-1 en C. elegans en un estado similar a DR20. Además, LIPL-1 degrada los lípidos en el proceso de lipofagia lisosomal. Sin embargo, aunque la expresión de hlh-30 aumentó significativamente en un momento temprano en comparación con la del NC (Figura complementaria S4), no hubo evidencia de que la remofuscina activara la vía de la lipofagia. Por tanto, los resultados de este estudio no explican la asociación entre la lipofagia inducida por remofuscina y la longevidad de C. elegans. Por lo tanto, se necesitan más estudios para determinar si la inhibición de la bomba de protones mediante el tratamiento con remofuscina contribuye a extender la vida útil de C. elegans y si la remofuscina funciona como un mimético de DR para extender la vida útil de C. elegans.

En conclusión, la remofuscina, inhibidor de la acumulación de lipofuscina, estimula la expresión del gen de la lipasa lisosomal lipl-1 y del gen del chaperona lipídica lisosomal lbp-8, aumentando posteriormente los niveles de expresión de los genes implicados en la detoxificación de xenobióticos a través de receptores hormonales nucleares y con ello extendiendo la vida útil de C. elegans.

Escherichia coli OP50 se obtuvo del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC, EE. UU.) de la Universidad de Minnesota y se utilizó como alimento para C. elegans. E. coli OP50 se cultivó en caldo Luria-Bertani (LB) (Ambrothia, Daejeon, Corea) a 37 °C durante la noche con agitación, se recogió mediante centrifugación a 3000 × g durante 10 minutos, se lavó en tampón M9 estéril y se diluyó a un concentración final de 0,1 mg (peso húmedo) por microlitro en tampón M940.

Se utilizó la cepa N2 de C. elegans Bristol, proporcionada por el CGC, como cepa de tipo salvaje. Las cepas mutantes VC1806 nhr-234 (gk865), VC4077 lbp-8 (gk5151[loxP + myo-2p::GFP::unc-54 3' UTR + rps-27p::neoR::unc-54 3' UTR + loxP]), VC875 cyp-35A1 (ok1414), RB2046 cyp-35A3 (ok2709) y RB2063 gst-5 (ok2726) fueron proporcionados por el CGC, y FX1954 lipl-1 (tm1954), FX1290 nhr-210 (tm1290) , FX30306 nhr-49 (tm7967), FX19275 nhr-8 (tm1800), FX01722 ahr-1 (tm1722), FX4598 pha-4 (tm4598), FX21842 cyp-35A2 (tm11844) y FX22344 cyp-35A5 (tm12345 ) fueron proporcionado por el Proyecto Nacional de Biorecursos (NBRP) para nematodos en la Universidad Médica de Mujeres de Tokio (Tokio, Japón). Los gusanos se mantuvieron y propagaron en un medio de crecimiento de nematodos modificado (mNGM) libre de peptona para prevenir la influencia negativa de los metabolitos producidos por las bacterias alimentarias proliferadas en los nematodos a 25 °C de acuerdo con técnicas previamente informadas41,42. E. coli OP50 se esparció en mNGM en placas de Petri de 90 mm de diámetro como alimento para los gusanos. Se utilizó una solución de hipoclorito de sodio e hidróxido de sodio (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) para obtener óvulos viables como se describió anteriormente43. Los huevos se transfirieron a placas mNGM frescas sembradas con E. coli OP50 y se incubaron a 25 °C hasta la etapa L4 (gusanos de 3 días), y todos los experimentos utilizaron la etapa L4 (gusanos de 3 días) como día. 1 de la etapa adulta para controlar el sistema reproductivo en C. elegans42.

Se disolvió remofuscina (amablemente proporcionada por el profesor Ulrich Schraermeyer, Universität Tübingen, Tübingen, Alemania) en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma Aldrich) y se administraron concentraciones finales de 0 µM (control), 50 µM, 100 µM y 200 µM. Se añadió una cantidad igual de DMSO (concentración final, 0,2%) como control. Se añadió 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR, Sigma Aldrich) (50 μM) a las placas44, que luego se sembraron con E. coli OP50. El ensayo de esperanza de vida media (MLS) de C. elegans se realizó transfiriendo 15 gusanos adultos jóvenes (etapa L4) a placas mNGM/FUdR que contenían E. coli OP50 y se trataron con remofuscina en las concentraciones indicadas. Para cada ensayo, se analizaron 45 gusanos en tres placas (15 gusanos por placa) para cada concentración de remofuscina. El ensayo de longevidad se realizó tres veces de forma independiente, al menos por triplicado, y se calificaron más de 100 gusanos. Los datos de tres réplicas independientes se fusionaron y analizaron. Las placas se incubaron a 25 °C y los gusanos vivos y muertos se contaron cada 24 h. Los gusanos se consideraban "muertos" cuando no respondían al toque suave de un recolector de gusanos. Los nematodos que se arrastraron fuera de las placas y murieron de forma no natural, como por ejemplo al embolsarse o adherirse a la pared de la placa, no se incluyeron en el análisis (censurados)45. Las lombrices se transfirieron cada dos días para mantener una fuente de alimento suficiente.

El MLS se estimó utilizando la siguiente ecuación. 46:

En la ecuación, j es la edad (día),\({d}_{j}\) es el número de gusanos que murieron durante el intervalo de días (\({\mathrm{x}}_{j}\) , \({\mathrm{x}}_{j+1}\)), y N es el número total de gusanos. El error estándar (SE) del MLS estimado se calculó utilizando la siguiente fórmula.

Los gusanos en la etapa L4 (día 1 de la etapa adulta) se transfirieron a placas mNGM (placa de Petri de 60 mm) que contenían diversas concentraciones de remofuscina y se sembraron con 5 mg (peso húmedo) de E. coli OP50 en tampón M9. Las placas se incubaron a 25 °C y la longitud del cuerpo de los gusanos vivos se midió cada 24 h hasta los 6 días de edad. En total, se midieron 10 gusanos por grupo. Se tomaron imágenes de C. elegans con un microscopio estereoscópico (Olympus SZ61, Tokio, Japón) y una ToupCam (UCMOS05100KPA, ToupTek, Hangzhou, China), y las imágenes se analizaron utilizando el software ToupCam. El área de proyección del gusano se estimó automáticamente y se utilizó como índice de la longitud del cuerpo. Se realizaron tres experimentos independientes para cada grupo.

Se realizó un ensayo de velocidad de bombeo faríngeo en placas mNGM sembradas con E. coli OP50 y tratadas con diversas concentraciones de remofuscina. Se transfirieron gusanos de tres días (etapa L4) a placas mNGM que contenían diversas concentraciones de remofuscina y se incubaron a 25 °C, y se contó el número de contracciones en el bulbo terminal de la faringe cada 48 h durante 1 min utilizando una Olympus. Microscopio invertido CKX41 (400 ×). Se realizaron tres experimentos independientes y se incluyeron 15 gusanos en cada grupo para cada medición.

La autofluorescencia de la lipofuscina en C. elegans adultos de 14 días se midió como índice de envejecimiento. Se colocaron gusanos seleccionados al azar de cada grupo sobre almohadillas de agar al 5% recubiertas con azida sódica 10 mM (Junsei Chemical, Tokio, Japón) en tampón M9 para anestesia. Se adquirieron imágenes de autofluorescencia de lipofuscina en una longitud de onda de excitación azul (405–488 nm), que captura 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), con un microscopio de barrido láser confocal (Olympus Ix81-FV1000)40. La fluorescencia se cuantificó utilizando el software FV10-ASW1.1 (Olympus) para medir la acumulación de lipofuscina. Se realizaron tres experimentos independientes y se incluyeron 10 gusanos en cada grupo para cada medición.

Se midieron los niveles de ROS en C. elegans tratados con remofuscina 0 µM, 50 µM, 100 µM y 200 µM durante 14 días. Los gusanos seleccionados al azar de cada grupo se lavaron dos veces con tampón M9, después de lo cual se eliminó el sobrenadante y el sedimento de gusano restante se suspendió en 100 µl de tampón M9. Se agregaron el sedimento de gusano (100 µl) y 100 µl de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína 50 mM (H2-DCF-DA, Sigma Aldrich) a los pocillos de una placa negra de 96 pocillos. Los niveles de ROS se midieron con un lector de microplacas de fluorescencia (SpectraMAX GEMINI EM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.) en longitudes de onda de excitación y emisión de 485 nm y 520 nm, respectivamente, 90 minutos después de la activación. La señal de fluorescencia en cada grupo, que incluía más de 80 gusanos para cada medición, se normalizó con la concentración de proteína en cada grupo. Se realizaron tres experimentos independientes.

Se recogieron gusanos alimentados con E. coli OP50 durante 14 días en placas NGM que contenían remofuscina 0 µM y 200 µM y se lavaron dos veces con tampón M9, después de lo cual se aisló el ARN total de gusanos enteros usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con un método previamente descrito13. Para cada ARN, la síntesis de las sondas de ARNc objetivo y la hibridación se realizaron utilizando un kit de etiquetado Aligent LowInput QuickAmp (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARNc amplificado y marcado se purificó en un módulo de limpieza de ARNc (Agilent Technologies) y los objetivos de ARNc marcados se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, EE. UU.). Después de comprobar la eficacia del etiquetado, el ARNc se fragmentó añadiendo agente bloqueante 10X y tampón de fragmentación 25X e incubando a 60 °C durante 30 minutos. El ARNc fragmentado se resuspendió en tampón de hibridación 2X y se pipeteó directamente sobre micromatrices de oligo C. elegans ensambladas (Agilent, 44 K). Las matrices se hibridaron a 65 °C durante 17 h utilizando un horno de hibridación (Agilent Technologies). Los microarrays hibridados se lavaron según el protocolo del fabricante (Agilent Technologies). Las imágenes hibridadas se escanearon utilizando un escáner de microarrays de ADN Agilent y se cuantificaron con el software Feature Extraction 10.7 (Agilent Technologies). Los datos brutos de intensidad se normalizaron globalmente47. Toda la normalización de datos y la selección de genes expresados diferencialmente (cambio de veces) se realizaron utilizando GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent Technologies). El criterio para la identificación de genes con expresión significativamente alterada fue un valor de p <0,05 en comparación con el control negativo. Los datos de secuenciación de ARN se depositaron en la base de datos NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (código de acceso: GSE144059). Para el gráfico circular y el gráfico del volcán, se utilizó el software de análisis de genes expresados diferencialmente basado en Excel (ExDEGA, eBiogen, Seúl, Corea) para analizar los datos de microarrays de acuerdo con los términos clasificados de ontología genética (GO). Los genes con un valor de p <0,05 y un cambio de 2,0 veces en comparación con el control negativo se definieron como genes significativamente modificados.

C. elegans alimentadas con E. coli OP50 durante 1 y 5 días en placas NGM que contenían remofuscina 0 µM y 200 µM se recogieron y se lavaron dos veces con tampón M9. El ARNm total se aisló de gusanos enteros utilizando TRIzol (Invitrogen) como se describió anteriormente13. El ARN se convirtió en ADNc usando un kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strand de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.) y luego se amplificó mediante qPCR usando SYBR Green (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, EE. UU.) y un QuantStudio. 6 Máquina de PCR Flex Real Time (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Para qPCR, se realizó un paso inicial a 95 °C seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 30 s, y se realizó un análisis de la curva de fusión. Los experimentos se realizaron de forma independiente al menos tres veces y los niveles de expresión relativos se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCT48. El gen de control interno act-1 se utilizó para normalizar los datos de expresión génica. Las secuencias de los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria S3.

En el ensayo de vida útil, se utilizaron el método de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico para calcular los valores MLS y p, respectivamente40. En los otros experimentos, la importancia de las comparaciones entre el control negativo (NC) y los grupos tratados con remofuscina se calculó mediante la prueba t de Student. La significancia se definió como un valor de p inferior a 0,05 en todos los experimentos. Si los datos no estaban distribuidos normalmente se utilizó la prueba U de Mann-Whitney42.

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por la Beca de la Universidad de Corea (K1822491).

Departamento de Ciencias Biomédicas y Biológicas Integradas, Escuela de Graduados, Universidad de Corea, Seúl, 02841, República de Corea

Miae Oh, Jiah Yeom y Young-Hee Lim

División de Cirugía Vitreorretiniana Experimental, Centro de Oftalmología, Universidad de Tübingen, 72076, Tübingen, Alemania

Ulrich Schraermeyer y Sylvie Julien-Schraermeyer

Facultad de Biosistemas y Ciencias Biomédicas, Universidad de Corea, Seúl, 02841, República de Corea

Young Hee Lim

Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Guro de la Universidad de Corea, Seúl, 08308, República de Corea

Young Hee Lim

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YHL y MO diseñaron la investigación; MO, JY y YHL realizaron los experimentos y analizaron los datos. Estados Unidos y SJ-S. preparó el material. MO y YHL escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Young-Hee Lim.

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Oh, M., Yeom, J., Schraermeyer, U. et al. La remofuscina induce la desintoxicación xenobiótica a través de una vía de señalización del lisosoma al núcleo para extender la vida útil de Caenorhabditis elegans. Representante científico 12, 7161 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11325-2

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Recibido: 16 de diciembre de 2021

Aceptado: 15 de abril de 2022

Publicado: 03 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11325-2

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La remofuscina induce la desintoxicación xenobiótica a través de un lisosoma